荧光素酶表达的淋巴瘤NCG小鼠模型的构建
动物的选择
NCG免疫缺陷小鼠为人源化小鼠模型，此品系缺失成熟的T细胞、B细胞和NK细胞，可以用来移植人类造血干细胞、肿瘤细胞。选用NOD-Prkdcem26Cd52（上标）Il2rgem26Cd22（上标）/Nju(NCG)免疫缺陷小鼠。
造模方法
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表达荧光素酶慢病毒质粒的构建
以慢病毒质粒lentiCRISPRv2作为骨架载体，lentiCRISPRv2质粒原表达框架为cas9及共表达的嘌呤霉素，将表达cas9的序列通过分子生物学手段替换成表达荧光素酶的基因序列，即可得到荧光素酶与嘌呤霉素共表达的病毒包装质粒。对lentiCRISPRv2进行XbaⅠ和BamHⅠ双酶切去除cas9表达框，酶切产物进行1%琼脂糖胶跑胶回收10000bp处条带，利用Addgene设计引物lentiCRISPRv2-luc+-F(5’-GAACACAGGACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3’)和引物lentiCRISPRv2-luc+-R(5’-GAAGTTTGTTGCGCCGGATCCACACGGCGATCTTTCCGC-3’)，以PLG-3 basic为模板，采用 PhantaMaxmastermixPCR扩增荧光素酶基因片段。ONEstepCloneKit(Vazyme)将lentiCRISPRv2胶回收产物和 PCR产物进行连接。连接产物转入E.coli DH5α大肠杆菌感受态，带氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)平板上筛选转化子，用引物lentiCRISPRv2-luc+-F 和lentiCRISPRv2luc+-R对转化子进一步筛选，并通过测序进一步验证，通过Snapgene进行序列比对，阳性克隆命名为lentiCRISPRv2-luc+。
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慢病毒的包被、浓缩
HEK293T细胞常规培养于高糖DMEM培养基中，于37℃恒温，5%CO2的培养箱中培养。选择生长状态良好的HEK293T细胞，于10cm培养皿接种约4×1000000胞，12~16h后达到70%~80%融合率。在一个无菌的5mL试管中，加入无血清Opti-DMEM培养基1.5mL，依次加入12.5μg的lentiCRISPRv2-luc+、10μgVSVG和7.5μgΔ8.91 3种质粒，轻轻混匀。在另一个无菌的5mL试管中，将60μL聚乙烯亚胺(PEI)(1ng/μL)稀释于1.5mL无血清Opti-DMEM培养基中，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释好的PEI缓慢加入混匀的质粒中，混匀，室温孵育20min，形成DNA-脂质体复合物，逐滴加入培养皿中，8h后换成完全培养基。收集转染后48h和72h的病清，4℃，4000r/min离心30min去除细胞碎片，并用0.45μm滤膜过滤，进一步去除细胞碎片；4℃条下，25000r/min超速离心2h，保留沉淀，利用RPMI1640培养基溶解沉淀即为浓缩病毒，将病毒分装，立即使用或冻存于-80℃备用。
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慢病毒滴度的测定
实时荧光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR，qPCR)法测定慢病毒的滴度，以lenti-luc+大抽质粒为标准品，测定标准曲线:利用阿佛加德罗定律推论，将lentiCRISPRv2-luc+逐级稀释成1010，109，108，107，106，105，104，103，100，10，0个拷贝等梯度浓度，每个梯度重复3次，设计引物:WPRE-F(5’-GGCACTGACAATTCCGTGGT-3’)和 WPRE-R(5’-AGGGACGTAGCAGAAGGACG-3’)，以逐级稀释好的质粒为模板，qPCR测定拷贝数和Ct值之间的相关性，并拟合成直线。吸取混匀的病毒，抽提病毒RNA，反转录成cDNA，以 WPRE-F和 WPRE-R为qPCR引物，测定Ct值，利用已经得到的标准曲线，计算出病毒拷贝数。由于病毒颗粒与病毒拷贝数一一对应，即可计算出病毒的滴度。
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嘌呤霉素最佳筛选浓度的确定
取对数生长期Raji细胞，按每孔5×105个接种于6孔板中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。嘌呤霉素按0，0.5，1，1.5，2，3μg/mL设置6个浓度梯度。在细胞接种24h后，将配制好的嘌呤霉素加入96孔板中，每个浓度设置3个重复孔，每天观察细胞生长情况，在48h内全部死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为筛选表达荧光素酶的Raji克隆细胞的浓度。
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慢病毒对Raji细胞的感染，阳性细胞
的筛选及扩增
取对数生长期的Raji细胞5×105接种于6孔板中培养24 h，加入浓缩后的病毒，以感染复数(MultiplicityOfInfection，MOI)=5感染Raji细胞，并加入终浓度为8μg/mL的polybrene，加入1mLRPMI1640完全培养基，37℃，5% CO2培养箱中静置感染24h后换成含10%胎牛血清的 RPMI1640新鲜完全培养基。继续培养24~48h，培养基变黄时，更换新鲜培养基。向慢病毒感染后72h的Raji细胞中加入合适浓度的嘌呤霉素，每两天更换一次培养基并维持嘌呤霉筛选直至得到阳性混合细胞。取1×10000个细胞加入荧光素酶底物，初步鉴定荧光素酶的表达；将嘌呤霉素筛选浓度提升到3倍，筛选荧光素酶高表达阳性克隆细胞，命名为Raji-luc+。
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荧光素酶活性鉴定
将Raji-luc+细胞传代5~10次，收集一定量细胞，按梯度稀释于96孔板中，每孔 Raji-luc+细胞数分别为2×104，1×104，5000，2500，1250，625，312，0个，用荧光素酶底物(Promega)，酶标仪检测细胞发光情况，检测细胞发光强度和细胞数之间的相关性；进一步使用活体成像对每孔Raji-luc+细胞数分别为4×104，2×104，1×104，5000，2500，1250，625个及4×104个Raji细胞的96孔板成像。
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NCG小鼠血液肿瘤模型的建立
随机将4~5周，体重15~20g，5只雌性NCG小鼠分成两组，空白对照(mock)组小鼠，实验组小鼠(n=4)每只尾静脉注射 Raji-luc+细胞1×106个。实验组取对数生长期的Raji细胞，用PBS重悬细胞密度为1×107/mL，实验组每只小鼠尾静脉注射100μL；mock组尾静脉注射100μLPBS，接种后第0d，9d，12d，15d，活体成像仪检测肿瘤成瘤情况。检测前使用戊巴比妥钠麻醉小鼠(计量为35mg/kg)，严格按照Promega说明书注射底物，10min内，进行活体成像分析肿瘤生长情况，并绘制小鼠体重变化曲线。
