今天我们介绍蝌蚪病毒(Head-Tail Virus)。蝌蚪病毒包括蝌蚪噬菌体(Caudovirus)与疱疹病毒(Herpesvirus)，首先，我们介绍的病毒是蝌蚪噬菌体的典型代表——大肠杆菌T4噬菌体(T4 Virus、Bacteriophage T4)。

简介

        大肠杆菌T4噬菌体是一种感染大肠杆菌的噬菌体。它是肌尾病毒(Myovirus)科T偶数噬菌体(Tevenvirus)亚科中的双链DNA病毒。大肠杆菌T4噬菌体是典型的烈性病毒。该物种以前被命名为T偶数噬菌体，该名称还包括大肠杆菌T2噬菌体、大肠杆菌T4噬菌体、大肠杆菌T6噬菌体以及其他菌株。

       噬菌体的意思是“细菌吞噬者”，众所周知，噬菌体是专性细胞内寄生虫，在宿主细胞内繁殖，当宿主被裂解破坏时被释放。T4噬菌体的完整基因组序列包含168903个碱基对，编码约300个基因产物。T4噬菌体在病毒学和分子生物学的发展中发挥了关键作用。

病毒历史

      噬菌体首先由英国科学家Frederick Twort于 1915 年和Félix d'Hérelle于1917年发现。 在1930年代后期，TL Rakieten向两位研究人员Milislav提出了原始污水的混合物或被原始污水感染的大肠杆菌的裂解物。德梅雷克和乌戈·法诺，这两位研究人员从大肠杆菌中分离出T3、T4、T5和T6。 此外，在1932年，研究人员J. Bronfenbrenner 研究并研究了T2噬菌体，从病毒中分离出T2噬菌体。而Max Delbrück参与了T偶数噬菌体的发现。 

       T4噬菌体分离的具体时间和地点尚不清楚，尽管它们很可能在污水或粪便中发现。1944年11月，Thomas F. Anderson、Max Delbrück 和 Milislav Demerec 在一篇论文中描述了T4噬菌体和T4样噬菌体。1943 年，Salvador Luria和Delbrück表明噬菌体抗性的细菌突变是在没有选择的情况下出现的，而不是对选择的反应。1943 年之前，细菌学家的传统观点是细菌没有基因。Luria-Delbrück实验表明，细菌与其他已建立的模型遗传生物一样，具有基因，并且这些基因可以自发变异产生突变体，然后可以繁殖形成克隆谱系。 那一年，他们还开始与另一位噬菌体实验者阿尔弗雷德·赫尔希(Alfred Hershey)合作。因为在病毒复制机制和遗传学方面的工作，三人将其享1969年诺贝尔生理学或医学奖。

        噬菌体小组是一个以Max Delbrück为中心的非正式生物学家网络，主要对T4噬菌体进行基础研究，并在20世纪中叶对微生物遗传学和分子生物学的起源做出了许多开创性的贡献。1961年，噬菌体小组的早期成员悉尼·布伦纳(Sydney Brenner)与弗朗西斯·克里克(Francis Crick)、莱斯利·巴内特(Leslie Barnett)和理查德·沃茨-托宾(Richard Watts-Tobin)在剑桥卡文迪什实验室合作进行了基因实验，证明了蛋白质遗传密码的基本性质。这些用T4噬菌体的rIIB基因突变体进行的实验表明，对于编码蛋白质的基因，该基因DNA的三个连续碱基指定了蛋白质的每个连续氨基酸。因此遗传密码是一个三元组密码，其中每个三元组(称为密码子)指定一个特定的氨基酸。他们还获得了证据，证明编码蛋白质的 DNA 序列中的密码子不相互重叠，并且此类序列是从固定起点读取的。

       在1962~1964年间，T4噬菌体研究人员提供了一个机会，可以研究几乎所有在实验室条件下对噬菌体生长至关重要的基因的功能。两类条件致死突变体的发现促进了这些研究。 一类这样的突变体被称为琥珀突变体。另一类条件致死突变体被称为温度敏感突变体对这两类突变体的研究导致对许多基本生物学问题的深入了解。 因此，通过对T4噬菌体的研究，人们了解DNA复制、修复和重组机制中所用蛋白质的功能和相互作用，以及病毒如何从蛋白质和核酸成分(分子形态发生)组装而成。阐明了链终止密码子的作用。一项值得注意的研究使用了编码T4噬菌体主要头部蛋白的基因缺陷的琥珀突变体。该实验为广泛持有但在1964年之前仍未得到证实的“序列假设”提供了强有力的证据，即蛋白质的氨基酸序列由决定蛋白质的基因的核苷酸序列指定。

        因此，这项研究证明了基因与其编码的蛋白质的共线性。

       许多诺贝尔奖获得者研究过T4噬菌体或T4样噬菌体，包括Max Delbrück、Salvador Luria、Alfred Hershey、James D. Watson和Francis Crick。其他研究过T4噬菌体的重要科学家包括迈克尔·罗斯曼、西摩·本泽、布鲁斯·阿尔伯特、吉塞拉·莫西格、理查德·伦斯基和詹姆斯·布尔。

病毒学特征

       T4噬菌体是一种相对较大的病毒，大约 90 nm 宽和 200 nm 长(大多数病毒的长度范围为 25 到 200 nm)。DNA基因组位于二十面体头部，也称为衣壳。T4噬菌体的尾巴是空心的，因此它可以将其核酸在附着后传递到它所感染的细胞中。像T4噬菌体这样的噬菌体具有复杂的可收缩尾部结构，大量蛋白质参与尾部组装和功能。尾纤维在识别宿主细胞表面受体方面也很重要，因此它们可以确定细菌是否在病毒的宿主范围内。 

       科学家通过电脑技术，对T4噬菌体13种不同蛋白质(基因产物 5、5.4、6、7、8、9、10、11、12、25、27、48 和 53)的127条多肽链的6百万道尔顿T4噬菌体基板的结构进行分析，创建了由gp54和主管蛋白gp19形成的尾管近端区域的原子模型。虽然卷尺蛋白gp29存在于底板-尾管复合物中，但无法建模。

       在T4噬菌体病毒粒子的组装过程中，由噬菌体基因编码的形态发生蛋白以特征序列彼此相互作用。 在病毒感染期间产生的每种蛋白质的数量保持适当的平衡似乎对正常的噬菌体 T4 形态发生至关重要。决定病毒体结构的噬菌体 T4 编码的蛋白质包括主要结构成分、次要结构成分和催化形态发生序列中特定步骤的非结构蛋白。Yap和Rossman详细介绍了T4噬菌体的形态发生分为三个独立的途径：头部、尾部和长尾纤维。

病毒基因组

       T4噬菌体的双链DNA基因组长约169kbp，编码289种蛋白质。T4噬菌体基因组是末端冗余的。在DNA复制时，可能通过滚环复制机制形成长的多基因组长度的串联体。包装后，串联体在相同长度的非特定位置被切割，导致几个代表原始循环排列的基因组。虽然是感染原核细胞的病毒，但是T4噬菌体基因组带有类似真核生物的内含子序列。

Shine-Dalgarno序列

       Shine-Dalgarno序列GAGG在病毒T4噬菌体早期基因中占主导地位，而序列GGAG是启动早期mRNA降解的T4核酸内切酶RegB的靶标。

病毒入侵

        T4噬菌体通过将OmpC孔蛋白和脂多糖(LPS)与大肠杆菌细胞表面的长尾纤维(LTF)结合来引发大肠杆菌感染。识别信号通过LTF发送到基板。这会解开与大肠杆菌细胞表面不可逆结合的短尾纤维(STF)。底板改变构象，尾鞘收缩，导致尾管末端的GP5刺破细胞外膜。GP5的溶菌酶结构域被激活并降解周质肽聚糖层。膜的剩余部分被降解，然后来自病毒头部的DNA可以穿过尾管进入大肠杆菌细胞。

       1952年，Hershey和Chase提供了关键证据，表明噬菌体DNA与蛋白质不同，在感染时进入宿主细菌细胞，因此是噬菌体的遗传物质。这一发现表明，DNA是大多数生物体的遗传物质。

复制

        裂解生命周期(从进入细菌到破坏细菌)大约需要30分钟(37 °C)。毒性噬菌体进入后立即在其细菌宿主中繁殖。子代噬菌体数量达到一定数量后，使宿主发生裂解，从而被释放出来感染新的宿主细胞。 宿主裂解和释放的过程称为裂解循环。裂解循环是病毒繁殖的循环，涉及破坏受感染细胞及其膜。 这个循环涉及一种病毒，它会超越宿主细胞及其繁殖机制。 因此，病毒必须经过5个阶段才能繁殖和感染宿主细胞：

1.吸附渗透(立即开始)

2.阻止宿主基因表达(立即开始)

3.酶合成(5分钟后开始)

4.DNA复制(10分钟后开始)

5.新病毒颗粒的形成(12分钟后开始)

       生命周期结束后，宿主细胞裂解，将新构建的病毒喷射到环境中，破坏宿主细胞。T4噬菌体的爆发大小约为每个受感染宿主100~150个病毒颗粒。

        Benzer(1955~1959)开发了一个系统，用于使用 rIIA 和 rIIB 基因缺陷的T4噬菌体突变体研究基因的精细结构。所采用的技术是互补测试和杂交以检测重组，特别是在缺失突变之间。 这些遗传实验导致发现基因内突变位点的独特线性顺序。 这一结果为关键思想提供了强有力的证据，即该基因具有相当于一段DNA的线性结构，具有许多可以独立变异的位点。

吸附渗透

       就像所有其他病毒一样，T偶数噬菌体不只是随机附着在宿主表面；相反，它们“搜索”并结合受体，即宿主表面发现的特定蛋白质结构。 这些受体因噬菌体而异；磷壁酸、细胞壁蛋白和脂多糖、鞭毛和菌毛都可以作为噬菌体结合的受体。为了让T偶数噬菌体感染宿主并开始其生命周期，它必须进入第一个感染过程，即噬菌体吸附到细菌细胞上。吸附是噬菌体-宿主对的一个重要特征，噬菌体在宿主细胞表面的吸附被描述为一个2个阶段的过程：可逆和不可逆。它涉及噬菌体尾部结构，当噬菌体尾部纤维帮助噬菌体与其宿主的适当受体结合时，该结构开始。这个过程是可逆的。底板的一种或多种成分介导噬菌体与细菌结合的不可逆过程。

      渗透也是噬菌体-宿主感染的一个重要特征，它涉及将噬菌体遗传物质注入细菌内部。 核酸的渗透发生在不可逆吸附阶段之后。 涉及噬菌体核酸渗透的机制对于每个噬菌体是特异性的。 这种渗透机制可能涉及电化学膜电位、ATP 分子、肽聚糖层的酶促分裂，或者所有这三个因素对于细菌细胞内的核酸渗透至关重要。 已经对T2噬菌体(T4样噬菌体)的渗透机制进行了研究，结果表明噬菌体的尾部不会渗透到细菌细胞壁内部，这种噬菌体的渗透涉及内膜上的电化学膜电位。

复制与基因组包装

 

      T4噬菌体基因组是在宿主细胞内使用滚环复制合成的。DNA在活细胞中复制所需的时间被测量为病毒感染的大肠杆菌中T4 DNA 延伸的速率。 在37°C下DNA呈指数增长期间，速率为每秒749个核苷酸。在T4 DNA合成过程中，每次复制每个碱基对的突变率为1.7x10^-8，一种高度准确的DNA复制机制，300个拷贝中只有1个错误。此外，该病毒还编码独特的DNA修复机制。T4噬菌体头部围绕支架蛋白组装成空的，随后降解。因此DNA需要通过一个小孔进入前头，这是通过gp17的六聚体首先与DNA 相互作用来实现的，DNA也充当马达和核酸酶。 已经发现T4 DNA包装电机以高达每秒2000个碱基对的速度将DNA加载到病毒衣壳中。 所涉及的功率，如果按比例放大，将相当于普通汽车发动机的功率。

病毒释放

        病毒繁殖和繁殖的最后一步是由宿主细胞释放病毒粒子决定的。 病毒粒子的释放发生在细菌细胞膜破裂后。病毒裂解宿主细胞，其特征是病毒蛋白攻击肽聚糖或膜。 当细胞内的衣壳释放分解细胞壁的溶菌酶时，细菌就会发生裂解。 释放的噬菌体感染其他细胞，病毒增殖周期在这些细胞内重复进行。

多重激活(MR)

      多重激活(MR)是两个或多个病毒基因组(每个都包含失活的基因组损伤)可以在受感染细胞内相互作用以形成可行病毒基因组的过程。Salvador Luria在1946年研究紫外线照射T4噬菌体时，发现了MR，并提出观察到的受损病毒的再激活是通过重组机制发生的。这在DNA确认之前 1952 年通过Hershey-Chase实验发现相关病毒T2噬菌体中的遗传物质。

        正如Luria所记得的，辐射病毒再激活(称为“多重激活”)的发现立即开始了早期噬菌体组内辐射损伤修复研究的一系列活动。后来发现，卢里亚发现的互助修复受损病毒只是DNA修复的一个特例。现在已知所有类型的细胞，不仅是细菌及其病毒，而且包括人类在内的所有研究过的生物体都具有修复DNA损伤的复杂生化过程。DNA修复过程现在也被认为在防止衰老、癌症和不孕症方面发挥着关键作用。

       MR通常由“存活曲线”表示，其中将多重感染细胞(多复合体)的斑块形成能力的存活率与基因组损伤剂的剂量作图。 为了进行比较，还针对基因组损伤剂的剂量绘制了单独感染细胞(单一复合物)的病毒噬菌斑形成能力的存活率。 上图显示了随着紫外线剂量增加，T4噬菌体复合物和单一复合物的存活曲线。由于存活率是以对数标度绘制的，很明显，多复合体的存活率超过了单复合体的存活率非常大的因素(取决于剂量)。多复合体的UV灭活曲线有一个初始肩峰。 其他T4 DNA损伤剂在其多复合体生存曲线中在X射线和甲磺酸乙酯(EMS)影响下存在一个“肩部”。肩部的存在被解释为意味着使用了两个重组过程。 第一个以高效率(在“肩膀”中)修复DNA，但随着损伤的增加其能力饱和；第二种途径在所有损伤水平上起作用。多复合体中存活的T4噬菌体未显示突变增加，表明紫外线照射下病毒的MR是一个准确的过程。 

         下图显示了DNA损伤剂丝裂霉素C(MMC) 灭活T4噬菌体的存活曲线。在这种情况下，多重复合物的生存曲线没有初始肩峰，表明只有上述第二次重组修复过程处于活动状态。 这一过程的修复效率由观察结果表明，即 1000 个单一复合体中仅允许1个存活的MMC剂量允许约 70%的复合体存活。对于DNA损伤剂P32衰变、补骨脂素加近紫外线照射(PUVA)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸甲酯(MMS)也获得了类似的多复合体生存曲线和亚硝酸。

       T4噬菌体中MR所必需的几个基因被证明是原核生物、真核生物和古细菌中重组所必需基因的直向同源物。 这包括，例如，T4噬菌体基因uvsX，它指定了一种蛋白质，该蛋白质与来自大肠杆菌的RecA和真核生物中的同源蛋白质RAD51和古细菌中的RadA具有三维结构同源性。有人提出，MR期间DNA损伤的有效和准确的重组修复可能类似于真核生物减数分裂期间发生的重组修复过程。

T4DNA连接酶

       T4 DNA连接酶来自T4噬菌体(一种感染大肠杆菌的噬菌体)，T4 DNA连接酶是实验室研究中最常用的。它可以连接DNA、寡核苷酸以及 RNA和RNA-DNA杂交体的粘性末端或平末端，但不能连接单链核酸。它还可以以比大肠杆菌DNA连接酶高得多的效率连接平端DNA。 与大肠杆菌DNA连接酶不同，T4 DNA连接酶不能利用NAD，它需要ATP作为辅助因子。

       科学家已经进行了一些工程来提高T4 DNA连接酶的体外活性； 例如，一种成功的方法测试了与几种替代DNA结合蛋白融合的T4 DNA连接酶，发现以p50或NF-kB作为融合伙伴的构建体在用于克隆目的的平端连接中的活性比野生型高160%以上。将片段插入质粒载体的典型反应将使用约0.01(粘性末端)至1(平末端)个单位的连接酶。T4 DNA连接酶的最佳反应温度为16°C。

        T4 DNA连接酶突变体对紫外线照射和烷化剂甲磺酸甲酯的敏感性增加，表明DNA连接酶用于修复由这些因子引起的DNA损伤。