生物信息快速入门

看完啦！

老师举例能力贼牛批，通俗易懂，便于俺们小白理解！

干货很多，可以帮助我们尽快对生信分析即将涉及到的内容有大致印象，部分细节自行进行了补充。

1 测序原理

见 notion

2 大片段文库

大片段文库：pairend（文库片段大于1k的片段）

小片段文库：matepair（文库片段小于1k的片段）

• 无论片段有多大，双末端测序只能测两端很短的部分（小几百bp）

大片段测序

目的：获得reads之间的物理距离关系（在序列拼接和基因组结构变异检测中有重要作用）。

面临问题：

1. 无法PCR太长的片段
2. 只测序很短的序列，合成大片段浪费

解决方案：环化处理，进行打断，选取生物素标记片段（包含首尾），接下来的过程与小片段处理完全一致。

3 测序原理

GCbias对测序的影响：

会影响PCR

GC正常范围：35%~65%

解决方案：PCR-free文库（详见notion or 公众号）

why不能一直测序下去？

后期错误率显著增加，随着反应进行，酶活性下降，反应条件发生较大改变，更重要的是phasing和pre-phasing，会对整体信号造成干扰。

测序中注意问题：

1. 必须保证DNA质量，不能降解
2. 样品量要满足建库要求
3. 要根据具体样品特点选择合适的建库测序策略
4. 测序要饱和（详见下节）

# 生信相关文件格式介绍详见notion or 公众号，eg. fastq, sam, bam and so on

4 测序饱和度评估

测序不饱和的影响：

1. 对于DNA基因组测序来说，影响序列拼接
2. RNAseq定量不准
3. 宏基因组不能准确反映物种的组成

5 数据质控

指标：

碱基含量分布（测序数据与基因组GC含量一致）

碱基质量分布（eg. 质量值>Q20为好碱基，Q20百分比指质量值大于等于20的碱基占总碱基的比例。注：Q值是描述单个碱基，Q20百分比是描述整体碱基）

# 生信相关软件使用及其算法详见notion or 公众号

6 测序数据过滤

去除哪些嘞：

1. 非“基因组”本身序列（adapter接头、测序引物、barcode、index等）
2. N碱基过多的reads
3. 低质量的数据（eg. 低于Q20碱基占一条reads总碱基的比率）
4. duplication（打断不随机造成的）
5. insertsize偏差过大的reads（可选）

注：

1. RNAseq与16S测序的duplication并不是打断不随机造成
2. 去除duplication会造成丰度信息丢失

7 短序列比对

短序列比对就是将这些测序的reads重新定位到基因组上，这个过程也叫做回帖或者mapping。

比对情况：

5 reads比对不到基因组上（0VS0）

8 短序列比对作用

两种情况：

1. 与自身基因组比对
2. 计算每个位点覆盖深度
3. 计算参考序列覆盖比率
4. 与参考基因组比对
5. RNA测序计算基因表达量
6. 宏基因组测序计算不同生物的丰度
7. 变异检测

作用

1. 计算reads利用率：reads利用率=比对到目标序列的reads数 / 总reads数
2. 计算覆盖深度与覆盖比率
3. 覆盖深度，coverage depth，也称为覆盖度，也叫乘数，是指每个碱基被测序的平均次数，是用来衡量测序量的首要参数。
4. 覆盖比率，coverage ratio，也称覆盖率，指被测序到的碱基占全基因组大小的比例。覆盖比率可以用来计算亲缘关系。

测序覆盖度与物理覆盖度：

短序列比对软件介绍了很多个，以后可深入学习，不过是不是只需要了解常用的即可嘞~

9 估计insertsize

插入片段insertsize大小，也就是文库片段的长度，同样也是两条测序reads的物理距离。

（insertsize大小包括reads长度）

10 计算RNAseq基因差异表达分析

RPKM：

但是可变剪切reads有时候无法比对回去

So，

现在改用TPM了，相较于前两者计算结果更准确。

比较基因的差异表达：

1. FC值
2. FDR校正

11 变异检测

处理有歧义的位点：

1. 质量值小于Q20
2. 落在重复区域的位点
3. 低频的位点
4. 利用概率模型进行过滤

12 物种组成与丰度计算

16S高变区测序

1. 数据过滤（注：这里数据过滤不可以去除duplication）
2. reads拼接为tags
3. tags聚成OTU（operational taxonomic unit）（可用mothur工具）
4. OTU进行分类
5. OTU物种分类
6. 得到物种组成及丰度

13 短序列比对FAQ

建立索引错误：

1. 目标序列不能太短，否则无法建立索引
2. 序列文件中不要有回车符
3. 选择正确的 bwa index 选项

短序列比对的资源消耗：

使用bam来减少数据存储

如何提高比对效率：

1. 完善软件算法
2. 提高计算机硬件资源
3. 比对前要对数据进行处理
4. 将数据拆分合并提高比对效率

短序列比对与长序列比对差别：

1. 长序列是比对多少的问题，短序列是比对有无的问题
2. 长序列可以允许更多的gap和错配
3. 亲缘关系太远，无法使用短序列比对，结果不好

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我是手动分割线嘿嘿嘿

14 序列拼接简介

序列拼接是生物信息分析的核心

测序reads——序列拼接软件——拼接结果

序列拼接存在问题：

1. 两条序列的方向
2. overlap的大小
3. overlap之间存在错配
4. 一条序列与多条序列之间存在overlap
5. 连接之后是否可以继续连接

相关名词：reads, pairend与matepair, insertsize, kmer, contig, scaffold...更多生信相关名词解释见 notion or 公众号

15 序列拼接（未理解透彻，后期需深入了解）

序列拼接可用数据：

1. 两条pairend关系reads
2. reads之间具有overlap
3. reads之间具有pairend关系

序列拼接两种算法：

1. Overlap-layout-consensus（popular for Sanger reads）
2. De bruijn graph（popular for illumina and Solid reads）

短序列拼接步骤：

1. 构图pregraph
2. 构建contig
3. 构建scaffold（包括map）
4. 补洞

详见其他......

序列拼接软件：

SOAPdenovo

velvet

SPAdes

Newbler

16 基因组污染分析

基因组污染特征：

1. 基因组明显偏大
2. 序列丰度不同
3. GC异常

序列唯一性：序列越长唯一性越高

污染鉴定：

1. 与NCBI比对进行鉴定
2. 预测16S（或18S）进行鉴定

污染处理：

由于序列之间存在相似性，丰度存在交叉，无法准确区分开污染序列与正常序列。故建议，重新提取样品进行建库测序。

17 RNAseq与meta序列拼接

DNA测序与RNAseq比较：

1. DNA一般为全基因组测序，而RNA测序的是转录出来的转录本，都是独立断开的片段；
2. DNA测序一般是均匀测序，基因组上的区域被均匀覆盖，而RNA由于存在表达丰度的差异，所以不均匀；
3. DNA全基因组测序中存在很多重复序列、干扰序列的拼接，而转录组中这个问题影响会小一些。

RNA序列拼接软件：

Trinity

oases

SOAPdenovo-trans

RNA拼接注意事项：

1. 拼接结果中获取unigene
2. 拼接时要去除duplication
3. 表达定量时不能去除duplication

宏基因组拼接：

宏基因组（metagenome），也称微生物环境基因组或元基因组。

18 序列拼接FAQ

影响拼接的因素：

内因：多倍体，基因组杂合，高度重复，低复杂度，GC偏差等

外因：测序数据量，测序质量，文库大小，kmer大小，基因组自身，拼接软件，阈值设定

如何改善拼接效果：

1. 覆盖基因组所有位点
2. 重新调整insertsize
3. 去除insertsize偏大的pairend reads
4. 调整kmer大小以及软件选项参数阈值
5. 混合拼接

不同测序平台之间测序数据混合拼接：

为什么不用短reads直接overlap拼接：

1. reads中存在错误率
2. 通过kmer去除包含reads中错误的位点

如何选择kmer大小（软件也不知道哈哈哈哈）：

1. reads准确度越高，选择大kmer较好
2. reads错误率高，选择小kmer，reads利用率高
3. 基因组本身特点，重复率，测序深度等因素，都会对kmer取值造成一定影响

为什么kmer只能是奇数：

主要是回文序列的影响，取偶数无法区分互补链和模板链

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基因组分析开始啦！

19 基因预测

基因预测方法：

1. 利用软件对物种基因组直接进行预测；
2. 通过同源序列比对，和已知近源物种基因及进行比对，将同源比对去筛选出来作为基因。

方法比较：

1. 从头预测：不需要同源参考基因序列直接进行预测，非常方便，适合于新发现的物种，没有很多已知的基因信息。
2. 基于同源基因的序列比对：找出的基因更加准确，但是如果没有同源序列，或者同源区不含有某个基因的话，就会漏掉一些基因。

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后续讲解均为概况，仅适用于粗略了解，可依据自身需求进行深入学习。

20 基因功能注释

ENCODE计划

21 非编码RNA分析

22 miRNA分析

23 重复序列分析

24 基因组特殊元件分析

CRISPR，CpG岛，操纵子，基因岛，启动子

25 共线性分析

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序列比对、变异检测，需深入学习！

26 变异检测

Denovo测序：如果一个基因组第一次被测序出来，我们一般称之为Denovo测序，主要是需要拼接其基因组。

重测序：已有基因组被发表出来后，重新测序的数据，可以不需要拼接，而直接用测序的reads进行短序列短序列比对分析，称为重测序分析，即文献中经常见到的“re-sequencing”，其实重测序本质就是找变异。

26 SNP检测

27 SV检测

28 CorePanGene集构建

29 系统发育树构建

数据上传！我一定会尽快用到的！

课程涉及知识点如果和自己研究方向相关性较大，建议去看更详细的教程进行针对性学习。

加油！

祝我们早日脱菜！！！