Disulfidptosis classification of hepatocellular carcinoma reveals correlation with clinical prognosis and immune profile

结果

HCC 中 DRG 的遗传概况

为了探索 DRG 在肝细胞癌中的作用，我们描述了它们的遗传图谱。TCGA队列中的364例HCC患者（TCGA队列中未提及其余患者的突变信息）中，有26例（7.14%）发生了二硫化物下垂基因相关突变的调控。FLNB和TLN1的突变频率较高，而样本中未发生SLC7A11等突变。9个基因的CNV扩增频率高于缺失频率，6个基因的CNV缺失频率高于扩增频率（。15 个 DRG 在染色体上的位置如所示。与正常组织相比，除 MYH10 和 IQGAP1 外的所有 DRG 在 HCC 中均上调。我们的研究还表明，13 个 DRG 的表达上调表明该 HCC 预后不良MYH10和IQGAP1在生存差异上没有差异。这表明 DRG 在 HCC 患者预后中的作用。

基于二硫化物表型的 HCC 分类模式鉴定

为了探索 DRG 在 HCC 中的表达特征，使用基于 15DRG 表达数据的共识聚类算法对来自 TCCA-LIHC 和 ICGC-LIRI-JP 队列的 602 个研究样本进行了聚类。通过聚类分析得到两个二硫化物簇A（253个样本）和B（349个样本）。PCA、tSNE和UMAP降维分析表明，An类和B类样本明显聚类。B 组患者在 Kaplan-Meier 曲线中的生存率优于 A 组（HCC 患者信息缺失）。热图显示 DRGs 在 A 亚型中比 B 亚型中表达更丰富。热图显示 DRG 在 A 亚型中比 B 亚型中表达更丰富。

两种二硫化物亚型之间的 TME 特征和免疫浸润

为了阐明 TME 中两种二硫化物亚型的特征，本研究计算了两个簇之间的免疫评分和基因表达。与之前的看法相反，簇 A 在免疫评分、基质评分和 ESTIMATE 评分方面高于簇 B。此外，大多数免疫细胞在 A 组中比在 B 组中更富集。其中，CD8+ T细胞、巨噬细胞、NK细胞、Treg 、APC共抑制、aDCs等免疫刺激因子在A亚型患者中均有显着表达。这表明共刺激因子和共抑制因子可能在簇中发挥各自的作用A. T细胞在免疫反应中主要由两种信号模式激活：MHC与T细胞受体的结合，分子信号的共刺激和共抑制。此外，我们分析了MHC相关基因的表达差异，共刺激/共抑制基因型之间的因子和免疫相关基因。大多数HLA家族基因在簇A中显着上调。近年新发现的MICA和MICB的表达也是一致的，共刺激因子和共抑制因子也在簇 A 中显示出表达优势因此，我们分析了高免疫浸润和免疫抑制的联合作用在 HCC 的肿瘤微环境中。

不同二硫化物亚型的生物学功能分析

应用 GSVA 分析两个簇的生物学行为。A组样本主要富集了多种癌症相关通路、免疫系统相关通路和细胞骨架蛋白相关通路。簇 B 富含生物合成相关途径。为了进一步探索聚类 A 和 B 中各自基因富集的途径相关性，我们使用了 GSEA 分析。簇 A 中的高表达基因富含细胞因子相互作用和ECM受体相互作用。低表达组基因集中于多种氨基酸代谢和胆汁酸生物合成。值得注意的是，B亚型中的高富集组富含多种氨基酸代谢、叶绿素代谢和胆汁酸生物合成。低富集组主要集中在细胞因子相互作用和ECM受体相互作用。细胞因子在肿瘤中发挥双向作用。IL-18通过激活NF-κB促进血管生成，诱导癌细胞增殖和侵袭，防止细胞凋亡。IL-6 同样促进慢性炎症性癌变并推动内在肿瘤进展。高剂量重组IL-2于1992年和1998年被FDA批准用于治疗转移性肾细胞癌（RCC）和黑色素瘤， 分别。细胞外基质（ECM）与多种肿瘤的进展有关，包括肝细胞癌、胰腺导管腺癌和乳腺癌。ECM 的硬化促进细胞增殖、上皮-间质转化、癌细胞转移和耐药性的发展。据报道，ECM 的硬化可促进肿瘤外泌体的释放并激活 NORTH 通路以促进肿瘤侵袭。这两种亚型的功能富集可能是导致患者预后差异的原因。

3.5 。二硫化物下垂预后模型的构建和验证

二硫化物下垂的分类在肝细胞癌（HCC）的临床预后中具有很大的潜力。为了更好地了解二硫化物下垂的特征，我们构建了一个预后模型。最初，我们从簇中识别出 681 个 DEG，并通过单变量 Cox 分析识别出 331 个预后相关基因。随后，对331个预后基因进行Lasso-Cox回归分析，最终鉴定出4个关键基因（表1）). 基于这些关键基因，我们构建了二硫化物下垂的风险评分。风险评分=(-0.1806*APOC1) + (-0.2229*IL7R) + (0.0851*SPP1) + (0.2528MYBL2)。我们根据风险评分将所有 HCC 样本分为高风险组和低风险组。与低二硫化物下垂风险组相比，高二硫化物下垂风险组的预后明显更差。测试组和训练组的 Kaplan-Meier 生存曲线证实。风险曲线分析表明，增加风险评分会增加他们的死亡风险。风险生存分析显示高危患者死亡率增加，生存时间相对较短。此外，我们证实了二硫化物风险评分在预测 1、3 和 5 年后的预后方面具有很高的准确性。整个样本的曲线下面积 (AUC) 值在 1、3 和 5 年时分别为 0.766、0.736 和 0.699。内部训练集中的 AUC 值分别为 0.808（1 年）、0.749（3 年）和 0.757（5 年）。测试集中的 AUC 值在 1、3 和 5 年时分别为 0.716、0.704、0.637

最后，我们使用 GSE14520 作为外部独立数据集来验证二硫化物风险评分的能力。我们对验证组应用了基于二硫键的风险评分，并将其分为高风险组和低风险组。已经证明低风险患者具有显着的生存优势。更重要的是，ROC 曲线对验证集队列具有显着的预后意义，1、3 和 5 年时的 AUC 值均高于 0.65。总的来说，我们的结果证明了二硫化物下垂风险评分在评估预后方面的良好潜力。

3.6 。二硫化物风险预后模型的独立预测价值

我们构建了一个二硫化物下垂风险预后模型，证明了生存差异。为了进一步调查，我们整合了所有样本的临床信息，并确定了三个共同的临床特征（年龄、性别、分期）。我们的分析表明分期和风险评分是HCC 的预后因素。风险评分和阶段的 ROC 曲线显示其在预测预后方面具有很高的准确性。我们还发现，B 组的风险显着低于 A 组。桑基图表明，低风险组主要由属于 B 亚型的患者组成，而大多数存活患者来自该组。相反，去世的患者具有更高的风险评分并且主要来自亚型 A，这与之前的分析一致

为了进一步验证我们的二硫键特征模型对 HCC 患者的适用性，我们将其与之前报道的模型进行了比较。在 TCGA-LIHC 队列中，Tang 签名[18]、Wang 签名[19]、Zhang 签名[20]和 Deng 签名[21]均显示出显着的生存差异，P 值小于 0.01. 4 个 HCC 特征模型的 AUC 值在 3 年和 5 年时均大于 0.60。比较二硫化物特征模型与其他四种模型预测生存事件的能力，我们发现在五种特征模型的C-index值中，二硫化物特征模型的值最高，为0.708，更接近完美模型，其次是唐签名（0.663），王签名（0.657），邓签名（0.659）和张签名（0.604）。此外，二硫化物特征模型的 RMS 值也是五个模型中最高的

3.7 。Disulfidptosis 风险评分在预测肿瘤治疗效果方面具有相当大的潜力

在本研究中，我们分析了不同 HCC 风险组之间的免疫浸润比例（，发现高危组浆细胞浸润更丰富。活化的树突状细胞（R = 0.33，P  = 0.018）与风险评分呈正相关。CD8T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、活化的 CD4记忆细胞和活化的树突状细胞与风险基因和评分显示出显着相关性. 免疫检查点是免疫治疗的重要靶点。CTLA4、HAVCR2、ATIC 和 OLA1 的表达与风险评分保持一致。HCC的免疫治疗一直是人们关注的焦点。我们还分析了二硫化物风险组与药物治疗之间的关系。抑制性免疫检查点基因CTLA4、HAVCR2、ATIC、OLA1在高危组较高。低风险组的 IPS 较高。低危患者免疫原性更强. 在 IMvigor210 免疫治疗队列中，CR/PR（完全缓解、部分缓解）组的风险值高于 SD/PD（进展性疾病、稳定疾病）。在比较具有不同免疫治疗结果的患者比例时，我们观察到与低风险组相比，高风险组中 CR/PR 患者的比例更高。具有高免疫原性的低风险患者比例较低可能是由于某种免疫抑制。

此外，TIDE 评分还评估了对免疫检查点抑制剂治疗的临床反应。高 TIDE 评分表明对 ICB 的低反应和不利的肿瘤结果。高危组TIDE评分、功能障碍评分较低。在高风险组中获得的较低综合 TIDE 评分可能是由于免疫治疗缓解的比例较高。

3.8 。肿瘤突变及药敏分析

由于与高突变负荷相关的抗原性增加，高风险 HCC 往往具有更长的生存时间。TCGA-LIHC高危组肿瘤突变率相对较高。虽然高突变组的预后比低突变组差但其免疫治疗效果在以往经验中占优势[22]。随后，我们分析了高风险组和低风险组之间的突变谱。171例高危患者的突变比例高达88.89%，190例低危患者的突变率为82.63%，TP53、CTNNB1、TTN ,MUC16和 PCLO 基因在两个风险组中都具有高突变频率。

为了确定高风险和低风险患者的敏感药物，我们分析了 197 种化疗药物的敏感性。敏感性结果显示，Afuresertib、KRAS(G12C)、多拉匹莫德、米托蒽醌和奥沙利铂在高危组中具有较高的敏感性。这些药物可能会改善伴有二硫化物下垂的高危 HCC 患者的预后。西地尼布、达沙替尼、多西紫杉醇、紫杉醇和托沙替尼在高危组敏感性较低，而低危人群可能受益于这些药物的治疗。

3.9 。构建列线图以预测 HCC 的存活率

为了更好地预测 HCC 的预后，我们构建了二硫键风险评分的列线图。本研究纳入的HCC患者特征信息见表2。在本研究中，HCC队列的患者生存数据排除了生存时间为0的患者信息。我们从三个HCC队列中获得了年龄、性别和分期三个临床特征，排除了信息缺失的患者。根据构建的列线图，每个患者根据临床信息对应评分的总和，可以得到1、3、5年的百分比生存系数。得分为236的患者1年、3年和5年生存率分别为0.756、0.496和0.248。高风险组的累积风险更高。校准曲线显示诺模图的预测结果接近实际概率。DCA 分析表明列线图和风险值具有更好的有效性。列线图在 1、3 和 5 年时的 AUC 值分别为 0.762、0.743 和 0.702（。内部训练集的 AUC 值均大于 0.75（1 年为 0.804，3 年为 0.760，5 年为 0.763。内部测试集证实了列线图 1、3 和 5 年总体生存的高精度。此外，在外部验证集 GSE14520 中，诺模图预测 1、3 和 5 年的 AUC 值均大于 0.6。校准曲线显示内部训练集、测试集和外部验证集都非常接近实际精度值。这些都表明二硫键相关列线图在预测HCC患者的生存时间方面具有很高的价值。

SPP1和MYBL2可预测HCC的预后

我们还分析了四种基因预测 HCC 预后的能力。ROC曲线的AUC分别为APOC1(0.425)、SPP1(0.651)、IL7R(0.487)和MYBL2(0.636)可见SPP1和MYBL2在预测肝细胞癌预后方面较为突出。基于二硫化物模型中的四种生物标志物，我们探索了它们在 HCC 中的能力。首先，我们收集了10对HCC及相应的邻近正常组织进行局部组织验证，从组织中提取收集RNA进行逆转录，然后用cDNA进行qPCR实验。PCR结果显示，HCC组织中APOC1、SPP1、MYBL2的mRNA含量高于癌旁组织。IL7R的mRNA水平在HCC组织中相对较低。APOC1、SPP1和MYBL2的蛋白免疫组化染色结果来自HPA。从图8k可以看出，APOC1、SPP1和MYBL2在HCC组织中呈中度或高度染色，在正常肝组织中呈弱染色。这与 mRNA 的水平一致。