使用Dragonfly进行鸡胚骨矿化过程分析

骨骼的形成是一个复杂而精密的生物学过程。在这一过程中，矿物质被转运和整合到胶原蛋白基质中形成具有特殊结构的复合体，从而实现骨的机械、生物和化学功能。骨的矿化需要转运和积累大量的钙离子在矿化部位，但钙离子作为细胞间通讯重要的信使，需要在细胞质中始终维持较低浓度以保证通讯的灵敏性，高等动物骨骼发育过程中协调二者矛盾的机制，目前仍未被阐明。

鸡胚由于具有骨形成速度快，骨骼体积较小能进行高分辨成像等优势，是科学家们研究骨矿化过程的良好生物模型。一只刚出壳的雏鸡体重约为38g（骨骼质量约8.1g），其体内的钙离子总量约为0.15g（3.5mmol）。钙离子从蛋壳运输到鸡胚骨骼生长部位主要依赖血清，孵化时雏鸡血清中钙离子浓度为2.55mM，由此可以计算出，雏鸡骨骼矿化过程需要约1.45L血清（其体积如图1立方体所示），这是小鸡孵化时骨骼体积的340倍，远超鸡胚所含血清体积。因此， 研究钙离子以低浓度在血清中转运，并在骨形成部位富集的过程，是解决上述问题的关键。

由前人的研究可知，在鸡胚中，游离的钙离子主要来自蛋壳，由高度血管化的绒毛膜运输到体内。当钙离子被转运到血清中时，主要由钙结合蛋白，特别是Fetuin-A，负责钙离子的转运。但钙离子离开循环系统后，在骨形成部位（如新形成的胶原样骨）的细胞和组织中富集和释放过程目前仍不清楚。为了保证钙离子介导的细胞通讯的正常进行，细胞质基质通常需要维持极低的钙离子浓度（约为100nM，小于血清中钙浓度2.55mM），因此，大量钙离子被储存在内质网和高尔基体等细胞器中，并在需要的时候通过离子通道释放。在成骨细胞中，钙离子的存储和运输更为重要，因为它需要运输大量钙离子以满足骨矿化需求，但钙离子等矿物在骨细胞内的运输机制仍未被阐明。

为了解释这一问题，科学家们需要对被运输的矿物前体进行大尺度的高分辨成像，以观察矿物前体从成骨细胞中运输到矿化部位的动态变化。 本文的研究者选用发育中的鸡胚作为研究对象，使用X射线断层扫描和冷冻FIB-SEM成像技术，对鸡胚的股骨进行高分辨率的三维成像，用以在接近自然状态的条件下观察和量化分析矿物前体在成骨细胞和矿化骨基质中的转运和沉积过程。本文中的图像分析和三维渲染均使用ORS Dragonfly软件完成。

首先，为了评估鸡胚骨矿化的进程，研究者们使用micro-CT对受精后（胚胎发育日，EDD）13天和14天的鸡胚进行成像（图2A,B），并划定股骨中心部位厚度1mm的区域为ROI进行后续分析。通过使用ORS Dragonfly软件对X射线成像数据进行阈值分割， 研究者们分别计算出EDD13和EDD14中ROI的矿化骨骼体积。结果表明，在EDD13到EDD14的一天时间内，股骨矿化体积从0.155mm3增加到0.268mm3，增长了73%。观察EDD13时股骨横断面背散射（BSE）图像（图2C）可以发现，股骨最内侧骨领更亮，即矿化程度更高，且沿着向骨膜侧方向，矿物密度逐渐降低，尤其在优先生长方向上降低更明显.苏木精和伊红染色（图2D,E）显示骨膜层富含成骨细胞。

为了进一步观察鸡胚中成骨细胞到骨膜的矿化物质流，研究者们使用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）层析成像对处于EDD13的三个不同标本的股骨中段进行成像，并对其中骨生长最活跃的部位——最外层骨小梁进行分析。图3显示了两种不同探测器对被矿化基质包围的骨细胞的成像结果。Inlens/SE混合检测器通过检测局部表面电位差成像，而BSE检测器通过记录材料中电子密度差异成像。图3A, B分别显示了一个嵌入矿化胶原蛋白基质和未嵌入基质的成骨细胞的Inlens/SE图像。在细胞内可以观察到囊泡结构。这些囊泡包含平均直径为80nm的颗粒结构（图3 A-B箭头）。当用BSE探测器观察时，研究者们发现这些颗粒含电子致密物质（图3C, D 箭头所指的亮点），即囊泡转运的矿物前体。有趣的是，并非所有Inlens/SE观察到的颗粒在BSE图像中都为致密颗粒。

此外，由图4可以看出，许多囊泡不含致密颗粒（黄色），即Inlens/SE图像所示的囊泡中没有颗粒结构，BSE图像中也未发现致密颗粒（亮斑）。因此在后续的分析中，研究者们只对含致密颗粒，即包含矿物前体的囊泡进行分析。

研究者们接下来使用ORS Dragonfly软件对三个样品中含有矿物前体的囊泡进行了分割。首先，他们使用slice registration 菜单中的SSD（sum of square difference）方法对同一样品的BSE数据集和Inlens/SE数据集进行了自动配准。为了提高图像质量，研究者们接下来构建了一个卷积滤波器用于增加对比度和降噪，并对Inlens/SE数据集额外增加了一个CLAHE滤波器，进一步提高图像对比度。为了准确分割FIB-SEM图像中的不同组分，研究者们接下来使用了深度学习模块，分别基于BSE数据集和Inlens/SE数据集训练了深度学习模型，用于分割致密颗粒、骨基质、囊泡、细胞核等组分。每个模型各使用20张人工标记的切片进行训练。

基于深度学习模型的分割结果，研究者们在三个样品中共找到432个含矿物前体的囊泡，它们的平均体积为0.65um3，且80%的囊泡体积小于1um3（图5A）。此外，研究者们还发现囊泡的体积与囊泡内矿物前体的含量成正相关（图5B）。三组样品的填充因子（囊泡内矿物前体的体积/该囊泡体积）均值约为9%（图5C）。

图6展示了样品2分割后的三维渲染图。在这个ROI中可以观察到含矿物前体的囊泡集中分布在矿化骨基质周围（图6A），且这些囊泡都位于骨细胞内（图6B），未观察到胞外囊泡。

研究者们共对三个样品中6-7个有细胞核的骨细胞进行了部分成像。这些细胞的空间位置不同，嵌入矿化基质的程度也不同。随着从成骨细胞向骨细胞分化，嵌入程度加深，这些细胞的胞质逐渐延伸，形成特殊的管腔（图6B，红色）。为了研究矿化基质中这些小管网络的结构和功能，研究者们观察并分析了样品电镜图像中矿化骨基质部分区域，如图7所示。

 图7展示了样品2骨基质部分的电镜扫描图和含骨基质内小管的3D渲染图。由于胚胎骨是编织结构，其中的胶原散乱排布，因此在图7A中，只有部分区域能观察到胶原纤维特有的67nm D -带。除此之外，还在骨基质中发现了未矿化的胶原纤维（黑色箭头所指区域）。在Inlens/SE通道的图像中，研究者们还发现了直径约为300nm的管状结构（图7A,B，蓝色箭头）。BSE通道图像显示，蓝色箭头所指的小管和白色箭头所指的纳米通道均衬度较低，表明这两种结构的矿化程度较低。其中较粗的结构明确的对应为小管，因为他们与矿化基质内的骨细胞相连。而白色箭头所指的结构在胶原纤维之间形成了一个纳米通道网络，这一通道系统占了的骨基质总体积的14%，并且直接与300nm的小管相连。

综上，本文的作者们提出了一个基于胞内囊泡主动运输的骨矿化分层模型（图8）。钙离子等矿化前体物质首先通过主动运输被储存在骨细胞的内质网等细胞器中，并在其中富集，形成富含矿物前体的囊泡。这些囊泡在细胞内被高速转运到骨形成部位，并通过胞吐作用被释放到骨基质中。其中的矿物前体通过纳米通道网络在骨基质中被动扩散，以达到矿化点位。在本文的模拟计算中，囊泡的运输效率足以完成鸡胚骨骼矿化任务。但由于本文中只考虑了含致密颗粒的囊泡，未考虑低电子密度的前体物质和可能不通过囊泡运输参与矿化的其他前体物质，因此估算的准确度仍有不足，需要结合其他研究方法进行补充完善。

本文灵活运用ORS Dragonfly软件，在多个不同来源（Micro-CT、FIB-SEM）的图像数据集上实现了图像配准，图像增强，降噪，基于阈值/深度学习模型的图像分割以及图像特征统计分析等功能， 值得大家参考学习。

参考资料

Raguin, E., Weinkamer, R., Schmitt, C., Curcuraci, L., Fratzl, P., Logistics of Bone Mineralization in the Chick Embryo Studied by 3D Cryo FIB-SEM Imaging. Adv. Sci. 2023, 2301231. https://doi.org/10.1002/advs.202301231

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