USP7是一种对DNA复制至关重要的SUMO去泛素酶
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今天推荐的是由西班牙国家癌症研究中心团队在2016年3月7日发表于Nature Structural & Molecular Biology （IF：12.474，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Oscar Fernandez-Capetillo教授，研究表明USP7是SUMO去泛素酶，对DNA复制至关重要。
研究背景
泛素（Ub）和类泛素对蛋白质的翻译后修饰，可用于调节DNA复制。复制子周围的染色质富含SUMO，而Ub较少，而成熟的染色质则呈现相反的模式。 如何在哺乳动物细胞中的DNA复制位点附近维持这种高SUMO，低Ub环境的方法尚待探索。在这里，作者将USP7鉴定为富含复制体的SUMO去泛素酶，这对DNA复制至关重要。
摘要部分
USP7通过作用于SUMO和SUMO酰化的蛋白质抵消了它们的泛素化作用。USP7的抑制或基因缺失导致Ub在SUMOylated蛋白上积累，而SUMOylated蛋白则远离复制体。 作者的发现提供了一个模型，该模型解释了复制叉处SUMO和Ub的差异积累，并确定了USP7在DNA复制中的重要作用，这些作用在开发USP7抑制剂作为抗癌剂时可作为参考。
研究内容
1.USP7活性对于DNA复制至关重要
为了确定复制体周围USP的相对丰度，作者进行了iPOND实验，并与绝对和相对定量的等价标签（iTRAQ）相结合，评估了它们在新生和成熟染色质中的存在。蛋白质组学分析显示，USP7与MCM复合体成员之间存在相互作用。作者发现，USP7免疫沉淀回收了MCM4，并且这种相互作用不受USP7抑制作用的影响。并通过其他数据表明，USP7是复制体相关的USP。
接下来，作者寻求通过使用特异性抑制剂P22077探索USP7在DNA复制中的功能。用高通量显微镜（HTM）测量， P22077处理HCT116细胞导致5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入的剂量依赖性降低以及磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）的增加。这些数据表明USP7抑制复制。与该结论一致，用P22077治疗导致PCNA单泛素化和随后的CHK1磷酸化。
研究结论：USP7存在于复制体附近，并且其活性是维持活性DNA复制并防止独立于PCNA泛素化或p53的复制压力所必需的。
2.USP7调节前叉前进和原点射击
为了了解USP7如何调节DNA复制，作者分析了复制叉进展和拉伸的DNA纤维中的起源活动。用三种不同的USP7抑制剂处理，导致正在进行的复制叉的速度大大下降。降低复制叉速度，如肿瘤基因的过度表达或暴露于基因毒性药物，会导致额外的 "休眠 "起源的激活作为补偿。相反，用三种药物中的任何一种抑制USP7，不仅降低了复制叉的速度，而且还减少了新起源的启动。USP7的表达明显反作用于对P22077的复制叉的降低，从而进一步支持抑制剂在DNA复制中的作用是由USP7引起的。
研究结论：USP7的活性促进了人类细胞的起源发射和复制叉的进展。
3.蛋白质组学分析确定SUMO为USP7靶标
为了研究USP7如何调控DNA复制，作者在染色质上寻找这个DUB的新底物。作者使用了最近开发的方法，该方法以免疫沉淀泛素化的肽为基础，用一种抗体识别泛素分子胰酶消化后留下的二甘氨酸残余（二甘氨酸法）。通过该方法作者确定了一个包含泛素化肽的区域，该区域在两个独立的实验中被USP7抑制后被富集。正如预期的那样，这个区域包括几个已知的USP7的目标。在作者的iPOND实验中，USP1，也富集在复制体上。此外， USP1的抑制强烈地增加了PCNA K164泛素化，而对大多数已知的USP7底物没有影响。是另一方面，在USP1抑制后，SUMO2上对P22077泛素化增加的赖氨酸没有一个被泛素化。
研究结论：抑制USP7对SUMO2的影响是选择性的，而不是染色质中存在的USP的一般影响。
4.USP7在体内和体外使SUMO去泛素化
接下来，作者评估了USP7是否能够在体外使SUMO2链去泛素化。作者将泛素化的聚SUMO2与重组USP7或USP1和UAF1一起孵育，并通过蛋白质印迹（WB）分析了反应的产物。如前所述，His-RNF4优先对长的多聚SUMO2链进行泛素化，但也催化由三到五个SUMO2分子组成的多聚SUMO链的单泛素化。不仅如此，作者通过MS确认了泛素化的SUMO2条带，该条带确定了SUMO2肽含有胰蛋白酶消化后产生的二甘醇泛素残余。此外，在体外经历USP7依赖性去泛素化的SUMO2的一些赖氨酸与体内USP7抑制后表现出增加泛素化的赖氨酸相一致（K11和K33）。与USP7孵化，而不是USP1，也减少了这些高度泛素化的物种的大小，从而表明USP7可以针对单泛素化和多泛素化SUMO2链。与这一结论相一致，重组的USP7（和USP1）可以裂解K48和K63多泛素链。因此，作者的结果证实，USP7是一种SUMO2脱泛素酶，可以从SUMO2链上去除单泛素和多泛素。最后，为了确定USP7是否也在体内对SUMO2进行去泛素化，作者通过免疫荧光（IF）测量染色质结合的SUMO2和SUMO3（SUMO2/3）的水平，发现在USP7抑制后，染色质结合的SUMO2/3有所增加且USP7的作用仅限于染色质。虽然在细胞膜中没有检测到变化，但观察到在USP7抑制后，SUMO2/3修饰的蛋白质在核可溶性部分，特别是染色质部分的积累。为了确定USP7抑制后积累的SUMO2/3修饰的蛋白质是否也被泛素化，作者用Ni-NTA树脂免疫沉淀泛素化的蛋白质后，测量了input和pulldown的SUMO化蛋白质的水平。正如预期的那样，用MG132抑制蛋白酶体导致input的SUMO化蛋白大量积累，而对USP7的抑制则影响较小。在抑制蛋白酶体或USP7后，SUMO化和泛素化的蛋白质都有强烈的增加。
研究结论：USP7是一个SDUB，它的抑制导致染色质结合的SUMO化蛋白的积累，这些蛋白也被泛素化。
5.segregase p97与USP7共同作用于染色质
虽然泛素化通常针对蛋白质进行降解，但作者观察到，USP7的抑制导致泛素化蛋白质在染色质上的积累。最近的证据表明，为了使染色质上的泛素化蛋白被降解，它们首先需要被p97分离酶提取。因此，因此作者分析了p97的抑制是否会进一步增加染色质上的SUMO化和泛素化蛋白的积累。将HCT116细胞暴露于p97抑制剂NMS873并不影响SUMO化蛋白的水平。相反，USP7的抑制增加了染色质上SUMO化和泛素化蛋白的水平，USP7和p97的联合抑制加强了这种积累。这些数据共同表明，USP7针对复制体上的SUMO化蛋白并限制其泛素化。然后泛素化的因子成为p97的底物，p97随后将它们从染色质中提取。
研究结论：USP7通过限制泛素化和随后被p97分离酶提取，促进了复制体周围SUMO化蛋白的集中。
6.USP7抑制作用降低了复制子上的SUMO丰度
如上所述，使用iPOND，作者发现复制体周围的染色质富含SUMO23。以前的研究表明，SUMO2/3在S期与PCNA共定位。因此，作者测试了USP7的抑制是否影响SUMO在DNA复制部位的富集。P22077对原代MEFs的处理导致了染色质结合的SUMO2/3共轭物的积累。尽管USP7抑制增加了染色质上SUMO化蛋白的数量，但它破坏了它们在PCNA病灶的定位（图5b）。相反，USP7的抑制并没有改变SUMO2/3和PML之间的共定位（图5c），从而支持SUMO化蛋白的脱域是对排斥因子的特异性。为了证实这一观察，作者在USP7抑制剂存在的情况下，进行了iPOND实验。正如预期的那样，与成熟染色质相比，SUMO2/3在新生DNA（EdU部分）中富集，USP7的抑制减少了SUMO2/3在复制体周围的富集。
研究结论：USP7的抑制导致SUMO化蛋白的泛素化，这反过来又促使这些SUMO化的因子远离复制叉的周围
7.USP7缺失概括了USP7抑制剂的作用
最后，作者试图对该发现进行基因确认。为此，作者使用了USP7条件性敲除（Usp7lox/lox）MEFs30。DNA纤维检测显示，USP7缺失后，叉子进展和原点发射减少。重要的是，与USP7抑制剂的作用类似， Usp7缺失会导致SUMO2/3修饰的染色质结合蛋白的积累。此外，在USP7缺失的MEFs中进行的IF实验证实了染色质结合的SUMO2/3共轭物的增加，以及SUMO2/3与PCNA的共定位的丧失。
研究结论：USP7是哺乳动物DNA复制所必需的SDUB，并确定USP7是维持复制叉周围富含SUMO的环境所需的第一个因素
研究结论：USP7是哺乳动物DNA复制所必需的SDUB，并确定USP7是维持复制叉周围富含SUMO的环境所需的第一个因素。
结论与讨论
综上所述，作者发现USP7是一个与复制体相关的DUB，可以抵消DNA复制位点的泛素化。USP7的作用有助于维持复制叉周围高浓度的SUMO化因子。在USP7被抑制后,SUMOylated蛋白被集体移出复制体，从而通过限制复制叉的进展和新起源的启动而完全废除了DNA复制。这些发现阐明了USP7在哺乳动物中的基本性质，在开发用于抗癌治疗的USP7抑制剂时应予以考虑。
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原文链接：https://www.nature.com/articles/nsmb.3185
