各样本外泌体提取
一、细胞外泌体提取（以MSC为例）
I. 准备
1） 将P3-P4 MSC 培养至70%-80%密度，10cm dish 或者T75装10ml Mediium；T175装25ml/瓶
2） 厚壁超速离心管清洗后高温高压灭菌备用（勿烘干），高速离心管及超离管盖、薄壁超离管用70% 乙醇浸泡20min消毒，然后用无菌PBS润洗晾干。
II. Conditioned medium的收集和处理
实验试剂： IMDM、PBS
准备耗材：灭菌好的EP管、灭菌好的玻璃瓶、50ml离心管、500ml玻璃瓶（无菌）
实验仪器：冷冻离心机、迷你离心机
实验步骤：
1. 将细胞培养至密度达到70%-80%满（超离一次可最多离心240ml，即24个10cm Dish or 10个 T175）
2. 弃去培养基，PBS润洗2次；
3. 换成同等体积的IMDM（如果需要加药处理，则在Conditioned medium更换前进行预处理）
4. 培养箱继续培养48小时 （不同细胞不一样，如生长较快的细胞，培养24小时即可）
5. 用移液管将conditioned medium收集到50ml离心管中，300g 4度离心10min（去除死细胞）
6. 利用移液管收集上清至干净50ml 离心管中，4℃保存最长1周或置于-80℃保存，或直接进行外泌体提取）
注意：conditioned medium收集后应尽快进行外泌体的提取，保存时间长会损失一些外泌体，也有研究者保存于-80度中数个月再提取外泌体。
补充：以下是全细胞裂解液的制备（total cell lysate）（用于外泌体免疫分析时作为对照组）
1. 用胰酶消化1-2个培养皿的细胞并进行计数；
2. 将1-5×107细胞装在小型离心管中（EP管）中，300g 4℃ 离心5min，弃上清，重悬在1ml 预冷的PBS中，再次离心并重悬在1ml 冷PBS中进行清洗，再离心弃上清；
3. 加200μl (for 1 × 107 cells) 或 1-ml (for 5 × 107 cells) 细胞裂解液，冰上孵育20min，孵育开始时和结束时涡旋混匀。（改为超声30s后50%pulse冰上轻摇15min，2016.01.29）
4. 20,000g 4℃离心20min（改为14,000g 4℃离心15min），收集上清至干净的微型离心管（EP管）中，-20℃保存最多6个月。
III.外泌体的提取
实验试剂：处理好的细胞培养基（Conditioned medium） PBS
实验仪器：离心机 离心管 -80°冰箱
实验步骤：
1. 将实验2中收集处理好的干净conditioned medium装入50ml离心管中
2. 2000g 4℃离心20min
3. 用移液管吸取上清转移至高速离心管中（注意不要污染，留下0.5厘米的上清不要吸）
4. 用记号笔标记高速离心，标记面朝上放置，16500g 4℃离心30min
5. 用移液管吸取上清至新的超速离心管（Type 50.2）里（盛0.5cm液面时就不要吸了）
6. 120,000g 4℃离心最少70min
注意：本步骤超速离心应保证每个离心管均至少有3/4液体，若不足，则应加PBS补足；时间超过70min(不超过3小时)并不会破坏exosome，即保证100000g离心大于60min
7. 完全弃除上清
注意：如为固定角度的转子，则本步骤可以倾倒弃除上清；如为悬吊式转子，则应用移液管吸弃上清，最后剩2mm液面即可
8. 在每管离心管中加入1ml 预冷PBS，用微量移液器（micropipettor）将沉淀重悬，将同一组细胞的管子的液体混合放到同一个超速离心管（Type 50.2或SW41均可）里，再加入PBS补足管内体积。
注意：本步骤可能并不能肉眼看见沉淀物
9. 120,000g 4℃离心60min
10. 尽可能地弃除上清液，用移液管和微量移液器缓慢弃去上清
11. 重悬沉淀（即exosome）：加少量（100μl/6 10cm dish）的预冷PBS重悬
12. 分出10ul装于新EP管用于测量蛋白浓度，剩余可100μl/EP管分装成小管-80℃冰箱保存
参考文献：Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006 Chapter 3:Unit 3 22
二、植物外泌体的提取
1. 对于多汁植物，清洁外皮，使用挤汁器榨汁；对于少汁植物，切成6mm×6mm×6mm左右的小块，使用榨汁机榨汁。收集到50ml离心管中。每次提取需集满4个50ml离心管。
2. 照217的超净台。以 3000g 30min 4℃离心以去除死细胞，收集上清液至高离管（4管→6管）。
3. 以 10000g 60min 4℃离心以去除细胞碎片。收集上清液。
4. 以 150000g 90min 4℃离心，保留沉淀。每管用2ml 8%蔗糖溶液重悬。
5. 可配制4~6管蔗糖梯度溶液（自上而下15%、30%、45%、60%，各1.5ml）。务必轻柔操作，以形成分层。
6. 继而轻柔加入有蔗糖梯度溶液的超离管中。
7. 以 150000g 90min 4℃离心，保留可见的各组分（若能看到条带，则吸取之；否则，两组分均收集。实际使用时选择15/30%和[或]30/45%的）。
8. 剩余100 ul用作NTA/TEM检测，放入-80℃。
三、动物血清外泌体的提取
1. 获得血浆：新鲜的全血1600g 20min 4℃离心。通常将1~2ml血浆作为一个样本。
2. 血浆10000g 30min 4℃离心，去掉细胞碎片等。下接3.1或3.2。
3. 1 上清稀释至~6ml，加入Quick-seal超离管（#344619），100000g 70min 4℃离心×2。
3. 2 或使用SBI的试剂盒（例如血清是EXOQ5A），按比例加入后低俗离心即可见沉淀。
4. 上接3.1或3.2。用100ul/超离管预冷的PBS稀释，充分吹打。
