摘要

PANoptosis 是一种新发现的细胞死亡途径，涉及细胞焦亡、细胞凋亡和坏死过程之间的串扰和协调。然而，PANoptosis 相关基因 (PRG) 在结肠癌预后和免疫景观中的作用仍然广为人知。在这里，我们对从以前的研究中确定的 19 个 PRG 的表达数据和从 TCGA 和 GEO 数据库获得的结肠癌患者的临床数据进行了生物信息学分析。结肠癌病例被分为两个 PRG 簇，并鉴定了预后相关的差异表达基因 (PRDEG)。然后将患者数据分成两个相应的不同基因簇，并分析风险评分、患者预后和免疫景观之间的关系。鉴定出的 PRG 和基因簇与患者的生存和免疫系统以及癌症相关的生物过程和途径相关。确定了基于七个基因的预后特征，并根据计算的风险评分将患者分为高风险组和低风险组。还根据风险评分和其他临床特征开发了用于预测患者生存的列线图模型。因此，高风险组预后较差，风险评分与免疫细胞丰度、癌症干细胞（CSC）指数、检查点表达以及对免疫疗法和化疗药物的反应有关。实时定量聚合酶链反应 (qRT-PCR) 的结果显示 LGR5 和 VSIG4 在正常和结肠癌样本之间差异表达。综上所述，我们展示了基于 PANoptosis 的分子聚类和预后特征预测结肠癌患者生存和肿瘤微环境 (TME) 的潜力。我们的发现可能会提高我们对 PANoptosis 在结肠癌中的作用的理解，并有助于开发更有效的治疗策略。

结果

结肠癌 PANoptosis 相关基因的遗传变异概况

从 TCGA 数据库下载 457 名 COAD 患者的表达数据，比较 41 名正常和 473 名肿瘤样本的 PRG 表达水平。本研究包括来自先前研究的 19 个 PRG。结肠癌患者 19 个 PRG 的体细胞突变发生率显示在图 1A; 399 个样本中有 81 个 (20.3%) 的 PRG 发生了改变。在 19 个 PRG 中，NLRP3显示出最高的突变频率。图 1B显示 PRG 中 CNV 改变在其染色体上的位置。与其在正常样本中的表达相比，12 个 PRG 在结肠癌样本中有差异表达。分析了 19 个 PRG 的体细胞拷贝数变化；ZBP1、GSDMD、AIM2和NLRP3具有最高的拷贝数变异 (CNV)，而CASP7、CASP1、CASP6和IRF3显示出显着的 CNV 降低（图 1C). 在这 12 个 PRG 中，7 个基因在肿瘤样本中上调，包括CASP8、FADD、TAB3、PSTPIP2、PARP1、MLKL和TRADD，而其他 5 个基因，包括NLRP3、TAB2、CASP7、RIPK1和RIPK3，在肿瘤样本中下调。肿瘤样本 ( p < 0.05) (图 1D).

结肠癌中 PANoptosis 相关基因簇的鉴定

为了探索 19 个 PRG 之间的相互作用及其预后意义，构建了一个网络，如图所示图 2A. 补充图 S1显示了 PRG 表达与结肠癌患者预后之间关系的 Kaplan-Meier 曲线。进行共识聚类分析以探索 PRG 表达与肿瘤分类之间的关系（补充图 S2）。确定了具有最高组内相关性和最低组间相关性的集群。通过增加聚类变量（k），我们发现当k =2时，分类符合标准。根据 PRG 表达水平，结肠癌患者被分为两个 PRG 簇（A 和 B）（图 2B). 如图所示图 2C, PRG 集群 A 中的患者的生存时间明显长于集群 B 中的患者 ( p = 0.048)。PCA 显示 PRG 簇 A 和 B 之间的分离令人满意（图 2D). 图 2E图显示了结肠癌患者中 PRG 簇与临床特征和 PRG 表达之间的关联。肿瘤浸润和淋巴结转移与 PRG 簇相关 ( p < 0.05)。GSVA 显示 PRG 簇 A 在免疫相关通路中显着富集，包括自然杀伤细胞介导的细胞毒性、抗原加工和呈递、原发性免疫缺陷、B 细胞和 T 细胞受体信号通路（图 2F). 为了评估两个簇之间免疫细胞浸润的差异，进行了 ssGSEA，结果显示 PRG 簇 A 具有更高的免疫细胞浸润水平，包括活化的 B 细胞、活化的 CD4 + T 细胞、活化的 CD8 + T 细胞-细胞、活化的树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和自然杀伤细胞（图 2G).

基于差异表达基因的基因簇鉴定

鉴定了 DEG，GO 和 KEGG 分析显示了相关的生物过程 (BP)、细胞成分 (CC)、分子功能 (MF) 和通路 (图 3A、B). 这些DEGs主要与T细胞活化的BP、白细胞细胞粘附、干扰素-γ反应相关，并与质膜外侧、主要组织相容性复合体（MHC）II类等CC相关蛋白复合物和MHC蛋白复合物。此外，它们还参与了免疫受体活性、趋化因子活性和抗原结合的 MF。根据KEGG分析，这些DEG参与了某些癌症相关通路，包括趋化因子信号通路、NOD样受体信号通路和NF-κB信号通路。使用单变量 Cox 回归分析确定 PRDEG。然后根据 PRDEG 表达将患者分为两个簇（基因簇 A 和基因簇 B）（补充图 S3；图 3C) 显示集群 A 的存活率高于集群 B ( p = 0.002)。在图 3D，箱线图显示FADD、CASP6、CASP7、IRF1、AIM2、ZBP1、CASP1、RIPK1、RIPK3和TRADD在簇 A 中上调，而TAB3和PARP1在簇 B 中下调 ( p < 0.05)。热图显示了基因簇与临床特征之间以及 PRDEG 表达与 PRG 簇之间的关联。此外，基因簇与肿瘤浸润和转移显着相关（p < 0.05）（图 3E).

与 PANoptosis 相关的预后特征的开发和验证

进行 LASSO 和 Cox 回归分析以筛选与预后相关的 DEPRG（图 4A、B). 选择后，根据以下公式将七个基因纳入风险评分的计算中：箱线图显示 PRG 簇 B 和基因簇 B 的风险评分高于 PRG 簇 A 和基因簇 A（图 4C、D). Sankey 图显示了 PRG 簇、基因簇、风险组和生存状态之间的关联（图 4E). 十九个 PRG 中的十五个在高风险组和低风险组之间差异表达（图 4F). 七个基因被用来构建预后特征；图 5A显示了这七个基因在两个风险组之间的表达差异。根据风险评分，将患者分为高危组和低危组，风险评分较高的患者死亡风险较高（图 5B). 如图所示图 5C，绘制了 KM 曲线以显示两组之间的生存差异。高风险组患者的生存概率显着低于低风险组患者 ( p < 0.001)。绘制ROC曲线检验风险评分的预测效率，1年、3年、5年生存率的AUC分别为0.612、0.650、0.676（图 5D). 还显示了 TCGA（补充图 S4）和GSE39582（补充图 S5）队列中的风险评分结果。风险评分和其他临床特征用于构建列线图模型（图 5E). 显示结肠癌患者诺模图预测生存概率与实际生存概率之间差异的校准图表明，预测生存概率接近实际生存概率（图 5F), 表明这个列线图模型准确地预测了结肠癌患者的生存。三个独立验证队列的结果，即GSE17536 (图 5G, p = 0.041, 1 年 AUC = 0.598, 3 年 AUC = 0.624, 5 年 AUC = 0.589), GSE17537 (图 5H, p = 0.048, 1 年 AUC = 0.728, 3 年 AUC = 0.624, 5 年 AUC = 0.542), GSE29621 (图 5I, p = 0.011, 1 年 AUC = 0.763, 3 年 AUC = 0.717, 5 年 AUC = 0.702), 表明风险评分可以有效预测患者的生存。

高危和低危人群肿瘤微环境的比较评价

图 6A显示风险评分与免疫细胞丰度之间的相关性：M0 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞与风险评分呈正相关，而幼稚 B 细胞、活化树突细胞、静息树突细胞、M1 巨噬细胞、静息肥大细胞细胞、静息 NK 细胞、浆细胞、活化记忆 CD4 + T 细胞、静息记忆 CD4 + T 细胞、CD8 + T 细胞和滤泡辅助性 T 细胞与风险评分呈负相关。还评估了免疫细胞的丰度与预后特征中的七个基因之间的关系（图 6B). 计算两个风险组的TME评分，发现高危组的基质评分较高，免疫评分较低（图 6C).

高危与低危人群突变、微卫星不稳定性及肿瘤干细胞指数比较分析

分析两组结肠癌患者体细胞突变的差异；高风险组和低风险组中突变最多的五个基因是APC、TP53、TTN、KRAS和SYNE1（图 7A、B). TMB (图 7C) 和微星 (图 7D) 与风险评分没有显着关系，而 CSC (图 7E) 与风险评分呈负相关 ( R = −0.15, p < 0.01)。

对免疫疗法和化疗药物的反应

为了分析风险评分预测潜在检查点阻断疗法的能力，绘制了箱线图以显示高风险组和低风险组之间免疫检查点基因表达的差异（图 8A). 检查点基因，包括CTLA4、LAG3、ID O 2、CD274和PDCD1，在低风险人群中具有更高的表达水平。在图 8B、cluster1 (C1)、C2、C3 和 C4 分别代表伤口愈合、IFN-γ 显性、炎症和淋巴细胞耗尽免疫亚群 ( Thorsson 等人，2019 年)。结果显示，C3样本在两组间分布几乎均等，但高风险亚组的C1和C4样本多于低风险亚组，C2样本较少。小提琴图显示了 IPS 与风险组之间的关系；较高的 IPS 代表对PD-1和CTLA-4阻断剂的更好反应（图 8C). 我们还发现，八种药物在高危人群中具有较低的 IC50 值，包括贝沙罗汀、比卡鲁胺、达沙替尼、多西他赛、艾司洛尔、伊马替尼、米哚妥林和帕唑帕尼（图 8D).

通过定量实时聚合酶链反应验证 LGR5、VSIG4、GZMB 和 ITLN1 的表达水平

在预后特征的七个基因中， LGR5、VSIG4、GZMB和ITLN1在来自 GEPIA 数据库的结肠癌样本中显着差异表达（补充图 S6）。通过qRT-PCR方法检测结肠癌和癌旁正常组织中LGR5、VSIG4、GZMB和ITLN1的表达水平。LGR5在肿瘤组织中的表达明显增高（图 9A) 而VSIG4在正常组织中的表达水平更高 ( p < 0.05) (图 9B). GZMB的表达水平无显着差异（图 9C) 和 ITLN1 (图 9D) 在正常和肿瘤样本之间。