基因工程—表达载体构建【选必三】|0基础救星！
喵喵 | 3-4 表达载体构建
1️⃣基因表达载体构建
- 目的
构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，复制，表达。
2. 过程
3. 基因表达载体的组成
基因表达载体包含目的基因、启动子、终止子、标记基因，（复制原点）。
启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
终止子：RNA聚合酶脱离部位，终止转录
标记基因：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，例如抗生素抗性基因，荧光蛋白合成基因等
（1）单酶切和双酶切
①单酶切的弊端
单酶切的结果：目的基因和质粒的正向连接，目的基因和质粒的反向连接，目的基因或质粒自连。只有目的基因和质粒的正向连接是基因工程中所需要的重组DNA。
②双酶切的优势
双酶切能保证目的基因与运载体定向连接，防止目的基因与运载体发生任意连接或自连。
例题1
质粒上有多种限制酶的切点，若目的基因上也有上述质粒中相应限制酶的切点，为避免目的基因自身的环化并能与图中质粒准确重组，可选用的限制酶是
A. Nde l和Xba l【Xba l在其他地方也有】
B. Nde Ⅰ和BamH l✓
C. Xba l【这是单酶切】
D. Pst l和BamH l
2️⃣目的基因导入受体细胞
植物细胞
常用方法：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
受体细胞：体细胞（具有全能性）
过程：（农杆菌转化法）
- ①将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上
- ②将含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌
- ③将含重组Ti质粒的农杆菌导入植物受体细胞
- ④T-DNA转移至受体细胞并将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，维持稳定和表达
动物细胞
常用方法：显微注射法
受体细胞：受精卵（全能性高）
过程：
- ①将含目的基因的表达载体提纯
- ②取受体细胞，用显微注射仪进行显微注射
微生物细胞
常用方法：Ca²⁺处理法
受体细胞：大肠杆菌等（繁殖快、多为单细胞、遗传物质较少）
过程
- ①Ca²⁺处理细胞，使之成为感受态细胞
- 感受态细胞：能够从周围吸取DNA分子
- ②将基因表达载体溶于缓冲液中与感受态细胞混合
- ③一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化
例题2
采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中
②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中
③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养
④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵
A. ①②
B. ②③
C. ③④
D. ①④✓
例题3
下列受体细胞与导入方法的匹配，正确的是
A. 棉花细胞——花粉管通道法
B. 羊受精卵——基因枪法【显微注射法】
C. 大肠杆菌——农杆菌转化法【Ca²⁺转化法】
D. 农杆菌——农杆菌转化法【Ca²⁺转化法】
3️⃣目的基因的检测与鉴定
探针：在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素（或荧光分子）标记
【DNA分子杂交技术】将转基因生物的基因组提取出来，在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素（或荧光分子）标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，就表明目的基因已导入受体细胞。
【核酸分子杂交技术】从转基因生物中提取出mRNA，同样用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。
【抗原-抗体杂交技术】从转基因生物中提取出蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。若有杂交带出现，表明目的基因已表达合成出蛋白质。
例题4
下列关于核酸分子杂交和抗原-抗体杂交的叙述，正确的是
A. 核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交【也可以mRNA和单链的DNA杂交，只要能碱基互补配对都可以叫做核酸分子杂交】
B. 抗原-抗体杂交的原理为碱基互补配对原则【抗原-抗体是蛋白质】
C. 核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录✓【存在是DNA跟DNA杂交，转录是mRNA跟DNA分子杂交】
D. 抗原-抗体杂交中目的基因产物常作为抗体【抗原】
