Cell Stem Cell | 肠隐窝结构内BMP信号梯度决定了分泌Wnt的干细胞生态位的自我组织

LGR5+肠道干细胞（ISCs）在肠道隐窝的底部进行自我更新，而它们的子代则在更高的隐窝层中增殖和分化，体现了肠隐窝的极性，上皮细胞的3D类器官在体外也复制了这些极性功能。经典的Wnt信号通路和BMP抑制剂（BMPi）是抑制肠道肿瘤的基础，这加强了增殖细胞对经典的Wnt/R-spondin（Rspo）信号和BMPi的依赖。然而，隐窝极性的程度和决定因素尚不完全清楚。位于ISCs附近的上皮潘氏细胞表达经典Wnt3，但在没有潘氏细胞的情况下，ISCs也是完整的，而上皮下的间充质细胞可能在维持ISCs和隐窝极性方面占据主导地位。SEMFs被认为是一个关键的Wnt来源，但它们集中在小肠隐窝顶部附近，表达大量的BMP，仅表达非经典的Wnt，并且在体外类器官培养中不支持ISCs，相比之下，PDGFRAlo CD34+滋养细胞在体外支持ISCs。一个空间分离的亚群（表达Rspo3和Grem1的隐窝下CD81+滋养细胞）在没有外源性生长因子的情况下独特地扩增了ISCs，并成功培养出肠道类器官。因此，SEMFs和滋养细胞可能为底部的ISC自我更新和顶部的BMP介导的上皮分化提供了相反的作用。

2023年4月，由Judith Kraiczy为第一作者在《Cell Stem Cell》杂志发表题为《Graded BMP signaling within intestinal crypt architecture directs self-organization of the Wnt-secreting stem cell niche》的文章，该文章率先证实了肠隐窝结构内BMP信号梯度决定了分泌Wnt的干细胞生态位的自我组织。

首先，作者采用单细胞测序技术以及流式细胞术分析PDGFRA细胞在肠道中的比例，结果表明，在PDGFRA表达的细胞中，PDGFRAhi的上皮下肌成纤维细胞的比例约为23%，而PDGFRAlo的基质细胞约为77%，这个细胞类群的分布情况在肠道不同部位中都是相似的。作者进一步通过转录组分析和染色质开放性测序，结果发现，表达PDGFRA的细胞主要分为3个细胞类群，分别是PDGFRAhi上皮下肌成纤维细胞（SEMFs）、CD81-PDGFRAlo基质细胞和CD81+PDGFRAlo滋养细胞，在它们在基因表达上具有高度的相似性，那么它们功能上的不同可能来源于其外源分泌因子的影响不同（图1）。

在与ISC自我更新相关的分泌因子中，经典Wnt是最重要的。Wnt3+ Paneth细胞位于体内ISCs附近，在没有补充Wnt的情况下，能够从小肠隐窝或分离的ISCs-Paneth双细胞中生长出类器官，而ISC则严重依赖间充质来源的Wnt配体。为了探究哪一类间充质细胞是经典Wnt的关键来源，作者使用Wnt依赖性功能测定法在体外培养肠道类器官以测试这种可能性，结果发现从Atoh1-Null（Paneth细胞枯竭）小鼠中分离隐窝，并在EGF、Noggin和RSPO1（ENR培养基）培养类器官无法构建产生类器官，而添加CHIR（GSK3抑制剂）则可以产生小鼠肠道类器官。为了进一步探究间充质细胞的Wnt分泌情况，提取Wnt缺乏的肠隐窝，分别与SEMFs、基质细胞和滋养细胞共培养，结果发现，基质细胞和滋养细胞都能培养建成肠道类器官，而SEMFs不能。因此，CD81-和CD81+ PDGFRAlo细胞（基质和滋养细胞）都是经典Wnt的来源（图2）。

进一步的研究显示，CD81-PDGFRAlo基质细胞具有功能异质性。在CD81-PDGFRAlo基质细胞中的CD55hi细胞表达更高的Rspo3和Grem1，更低的非经典Wnt4，这种极性是由它们相对隐窝的距离所决定的。小肠隐窝与结肠/小肠CD55lo或CD55hi细胞共培养实验显示，CD55hi细胞形成了大量体积更大的肠道类器官。因此，CD81-基质细胞的CD55hi细胞亚群支持了间充质细胞生态位的极性，当隐窝与未分类的PDGFRAlo细胞培养时，互补的非经典Wnt4+细胞部分可能抑制了这一现象（图3）。

BMP信号在PDGFRAlo细胞中调控肠道干细胞生态位更新分化因子的基因表达，靠近隐窝基底部的间充质细胞是支持ISCs更新分化的的位置，隐窝顶端的SEMFs是分泌BMP因子的主要细胞，BMP浓度也具有梯度特性。SEMFs细胞分泌的BMP可以与CD81-PDGFRAlo基质细胞上表达的BMP受体结合，进而调控BMP信号相关基因的表达，抑制BMPi的表达（图4）。

进一步研究发现滋养层细胞强大的ISCs活力导向性归因于其表达的Rspo3和Grem1，这两个基因在滋养层细胞表达最强，在CD81-基质细胞中也有少量表达，从隐窝底部的滋养层细胞向隐窝顶端的SEMFs，Rspo3和Grem1分泌表达逐渐减少，而非经典的Wnt配体（Wnt4）分泌表达逐渐增加。作者通过荧光标记小鼠、原位杂交实验等确认Grem1+细胞与Wnt4+细胞不对称的分布在小肠和结肠中，这是由BMP信号调节的。CD81-PDGFRAlo基质细胞离隐窝顶端的SEMFs的距离决定了其分泌因子是BMP激动剂还是BMPi，这也体现了这两群细胞在维持ISCs活性方面的不同作用。在体外共培养肠道类器官和CD55hi CD81-PDGFRAlo基质细胞，长期的BMP因子作用形成肠道类器官更小，这表明PDGFRAlo细胞的极性及功能异质性不是由其本身特性决定的，而是由其所处隐窝的位置决定的（图5）。

来自周围生态位的信号驱动肠隐窝底部的肠道干细胞增殖并抑制其分化，在上皮下的间充质细胞中，隐窝底部的CD81+PDGFRAlo滋养细胞能够在体外维持ISCs功能，必要生态位因子的梯度表达不是细胞自主决定的，而是由BMP分泌的距离决定的。BMP信号传导抑制隐窝顶端附近PDGFRAlo细胞的ISCs营养基因，这种抑制在隐窝基部附近和下方的基质细胞（包括滋养细胞）中可得到缓解。