「青莲聚焦」综述|阿尔茨海默症的蛋白质组学景观：发病机制和生物标志物发现的新见解

       阿尔茨海默症（AD）是一种与衰老相关的神经退行性疾病。据估计，全世界约有5000万人患有阿尔茨海默症和其他类型的痴呆。该病的主要临床表现为严重的认知功能减退、进行性记忆丧失、逆行性和顺行性健忘症，并伴有严重的组织病理学改变，如海马体退化和随后的皮质丧失。广泛的分子研究揭示了这种疾病的病理特征是β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集和tau蛋白过度磷酸化。尽管数十年来进行了积极的研究和药物开发，但尚未完全了解这种大脑退化的确切原因。2021年08月12日，Molecular Neurodegeneration（IF：9.599）杂志上在线发表了题为“Proteomic landscape of Alzheimer’ s Disease: novel insights into pathogenesis and                      biomarker discovery”的综述论文。该文讨论了蛋白质分析技术应用的历史、现状和未来，提供了AD蛋白质组学的整体图景，揭示了AD的发病机制和潜在生物标志物的新见解。

蛋白组分析和质谱技术的发展

      概述了上个世纪基于质谱（MS）的蛋白质分析的主要事件（图1）。

       基于质谱的蛋白质组学分析通常包括三个主要步骤：(i)质谱前样品处理；(ii)质谱数据采集；(iii)质谱后生物信息学分析，每个步骤都提供了多种策略来实现蛋白质鉴定和定量的最终分析目标。

       除了MS，还可以使用特定的亲和试剂来分析蛋白质，例如基于抗体（例如蛋白质芯片、ELISA和邻位延伸分析技术(proximity extension assay，PEA)）和基于适配体（例如SOMAscan）。这些非MS技术在处理大量样品时是有利的，但目前试剂可用性和特异性的缺陷阻碍了全蛋白质组的覆盖率。

AD蛋白质组的无偏分析

      到目前为止，三个独立的研究组分别使用TMT-LC/LC-MS/MS平台从总共192个AD和对照样本（图3）中获得了七个深层蛋白质组数据集（每个数据库识别>8,000个蛋白质）。这些数据集为荟萃分析提供了一个极好的机会，以增强统计能力。将这些数据集汇编成共12,017个蛋白的列表，计算了log2(AD/CONTROLY)比值和p值，然后用Fisher’s方法和Benjamini-Hochberg进行FDR校正，筛选得到2,698个差异蛋白(FDR<1%)。并根据不同细胞类型汇总了特定蛋白图谱，DE列表包含638个细胞类型特定蛋白，包括140个星形胶质细胞、337个神经元、10个少突胶质细胞、118个小胶质细胞和33个内皮细胞。支持了多种细胞类型在AD发病机制中的作用。

蛋白质组学图谱揭示AD进展机制

         基于AD的蛋白质组学分析数据，作者绘制了一个简单的平衡模型来讨论已识别的DE蛋白在AD发展过程中的作用（图4）。在AD无症状阶段激活的生物学过程和细胞通路中，有些可能发挥保护作用。然而，随着疾病进展过程中有害损伤的加剧，保护作用已经耗尽。由此产生的不平衡导致神经元退化和临床症状的出现。

       在AD发病之前，一些已确定的DE蛋白可能起到保护作用，如Netrin-1(NTN1)、Netrin-3(NTN3)、Midkine(MDK)、PTN、HGF和WNT5B，特别是在表现出高Aβ病理但没有临床症状的病例中。与AD相关的DE列表中包含大量补体蛋白（C1QA、C1QB、C1QC、C1QL1、C1QTNF5、C1R、C1S、C3、C4A和C4B）。在大规模的GWAS分析中，补体基因CR1和C7被确定为AD的危险基因。在AD(APP/PS1)小鼠中敲除C3被证明可以挽救突触丢失和记忆衰退。在tau病理模型(PS19小鼠)中敲除C3aR(C3a受体)也可以减少炎症、突触缺陷和tau病理特征。因此，补体系统会影响阿尔茨海默病进展中的多种分子和细胞事件。此外，还有一些神经营养因子在从MCI到AD的转变过程中减少，例如VGF、BDNF、NRN1和CRH。但这些AD相关蛋白的功能很可能在疾病长期发展过程中是多因素的，并且它们是起到保护作用还是有害作用取决于时间、区域和细胞环境。

AD中的翻译后修饰蛋白质组

         体内蛋白质功能受到无数翻译后修饰和动态蛋白质-蛋白质相互作用的严格调控。在表现出tau病变的神经退行性疾病中，tau纤维结构上的不同构象可对疾病亚型进行分类。Tau聚集与广泛的PTMs相关，包括磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化、糖基化、苏木化和氧化等。最近报道了一系列通过MS策略对AD大脑进行的全面的tau PTM分析。在42例对照组和49例AD患者的多个tau亚型上，共鉴定出95个修饰事件(磷酸化55个，泛素化17个，乙酰化19个，甲基化4个)。PTM可能按顺序发生，并通过改变表面电荷来促进tau聚集和播种活性。AD患者tau PTM的这些图谱揭示了分子异质性和疾病的分期。目前的MS平台和富集策略使得能够对AD标本中的PTMs进行蛋白质组范围内的集中分析。已经出现了大量的数据集，特别是在磷酸蛋白质组中，大量的PTM信息也可以在线获得(www.phosphosite.org)。总之，这些全面的PTM数据集对于研究AD发病机制期间的信号通路具有重要意义。

基于蛋白质组学的AD生物标志物的发现

       基于质谱的脑脊液蛋白质组学研究，在发现生物标志物方面取得了令人振奋的进展。作者整合了6个深层脑脊液蛋白组学的数据集(每个>1,000个蛋白，总计260个AD和对照组)，共获得5939个蛋白数据，其中包括311个上调蛋白和165个下调蛋白（图5，FDR < 1 %）。为了加强对特定CSF生物标志物的选择，整合CSF和脑蛋白质组数据集。将脑脊液中的这些DE蛋白与脑蛋白质组取交集，共获得65种关键上调蛋白（例如MAPT、SMOC1、HTRA1、PDLI M5、PRDX6、RUVBL2、CALB2、ARFGAP3、SPP1和DPCD）和44种关键下调蛋白（例如NPTX2、VGF、PDHA1、NDUFV1、NDUFA2、NDUFA12、NDUFA13、NDUFS3、ATP5B 和 ATP5J）。荟萃分析为未来验证提供了AD CSF蛋白质组资源。细胞外囊泡（EV）能够将脑蛋白转运到血液中，因此血液也成为研究AD的另一种可行性样本。EV是高度异质的纳米级脂质囊泡，可以释放到细胞外环境中进行细胞通讯。EV可携带和传播AD相关蛋白，包括APP、Aβ和tau等。越来越多的证据表明EV蛋白成分与AD相关，因此对于EV蛋白质组学进行全面分析有利于更全面的表征AD生物标志物。

总结：

        总之，目前的深度蛋白质组学研究已经以前所未有的规模对大脑和生物流体进行了分析，提出了许多新的假设以供后续验证。值得注意的是，AD是一种不可逆的神经退行性疾病，是一种接近终末期的疾病，其中许多细胞途径和生物过程受到干扰。随着基于MS或非MS蛋白质组学方法的进一步发展，发现更多的分子改变和特征蛋白质也就不足为奇了。同时，根据这里讨论的这些分子见解的假设开发新的AD模型，为AD和AD亚型提供潜在的治疗策略和新型候选生物标志物。