单细胞转录组：骨髓免疫细胞应对波动的营养压力来限制体重反弹

2023年9月，中南大学罗湘杭团队在Cell Metabolism（IF=29）发表题为“Bone marrow immune cells respond to fluctuating nutritional stress to constrain weight regain”，该研究对通过单细胞转录组测序，确定了一种独特的骨髓来源的代谢记忆免疫细胞群，可以靶向对抗肥胖。

题目：Bone marrow immune cells respond to fluctuating nutritional stress to constrain weight regain

发表期刊：Cell Metabolism

影响因子：29

发表年月：2023年9月

材料：正常食物饮食（ND组）、高脂饮食（HFD组）、循环HFD组（Cyc组）小鼠的骨髓（BM）免疫细胞

方法：10×Genomics scRNA-seq

肥胖是一种世界性的流行病，导致代谢紊乱的发病率增加，包括胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压和各种形式的癌症。目前，肥胖的主要治疗方法包括生活方式和药物干预，以及减肥手术。虽然许多这些治疗最初是有效的，但维持10%以上的体重减轻是很困难的。大多数人在体重明显减轻后，体重容易反弹。因此，控制体重反弹对治疗肥胖患者至关重要。骨髓(BM)是循环和组织浸润免疫细胞的关键储存库。研究表明，肥胖可引起BM微环境的改变，导致BM显著重塑，免疫细胞数量和功能发生改变。肥胖是如何影响BM定位的免疫细胞并相互调节体重恢复的，目前尚不清楚。

Result 1波动的营养压力使BM免疫细胞具有抗肥胖特性

CD45.1小鼠喂食高脂饮食(HFD) 5周以诱导肥胖，然后再喂食3周的高脂饮食(HFD组)或切换到3周的正常食物饮食(ND)来减肥(循环HFD组，以下简称Cyc组)，以连续8周饲喂ND的小鼠为对照组(ND组)。然后从ND组、HFD组和Cyc组小鼠中收集BM免疫细胞，转移到野生型(WT) CD45.2小鼠中，重组5周后，受体小鼠体重全部恢复，重组成功。与移植ND或HFD小鼠的脑源性免疫细胞相比，移植Cyc小鼠的脑源性免疫细胞的受体小鼠体重恢复明显较低。移植了Cyc小鼠BM免疫细胞的小鼠表现出葡萄糖耐量（GTT）改善，胰岛素敏感性（ITT）增强，组织重量减少和更小的脂肪细胞。此外，从移植了Cyc小鼠来源的BM免疫细胞的小鼠中收集的棕色脂肪组织(BAT)和腹股沟WAT (iWAT)显示，与ND组或HFD组的BM免疫细胞重建的小鼠相比，UCP1和产热基因(UCP1和Ppargc1a)的表达增强，揭示了Cyc小鼠来源的BM免疫细胞在促进脂肪产热方面的惊人作用。饮食改变会导致体重减轻， BM免疫细胞通过增加受体小鼠的能量消耗以维持主要代谢稳态 (图1)。

图1 波动的营养压力使BM免疫细胞具有抗肥胖特性

Result 2 scRNA-seq揭示了减肥后小鼠和人类BM中干细胞样CD7+单核细胞的积累

从ND、HFD和Cyc组小鼠中收集BM免疫细胞，并进行scRNA-seq。在HFD和Cyc小鼠的BM中，骨髓细胞（包括单核巨噬细胞和中性粒细胞）的比例显著升高，而淋巴细胞（包括B细胞、T细胞和NK细胞）的比例显著降低。这些结果与肥胖相关的骨髓免疫细胞转移一致。单核细胞和巨噬细胞进一步分为6个cluster，其中cluster 5和cluster 6在Cyc小鼠中分别表现出明显的增加和减少。拟时序分析结果显示，从普通髓系祖细胞(CMPs)和多祖细胞(MPPs)，单核细胞和巨噬细胞的前体，逐渐过渡到cluster 5和最终的其他cluster。SCENIC分析显示，Klf4、E2f1和Tfdp1均与干细胞稳态和细胞周期相关，是cluster 5的前3位转录因子。CD7和Flt3鉴定为cluster 5的top marker基因。研究者将cluster 5定义为CD7+单核细胞。饮食诱导的骨髓CD7+单核细胞具有干细胞样特征。总之，scRNA-seq揭示了CD7+单核细胞，显示干细胞样特性，在体重减轻后在小鼠和人类的BM中积累，这可能在肥胖控制中发挥作用（图2）。

图2 scRNA-seq揭示了减肥后小鼠和人类BM中干细胞样CD7+单核细胞的积累

Result 3 CD7+单核细胞优先迁移到iWAT 

为了进一步确定CD7+单核细胞在肥胖调节中的直接作用，从Cyc小鼠中分离出BM来源的CD7+和CD7-单核细胞，并过继性转移到肥胖前期的WT小鼠中。转染CD7+单核细胞的小鼠体重增加减少，葡萄糖耐量改善，胰岛素抵抗减轻，组织重量减轻。CD7+单核细胞受体小鼠的氧消耗和能量消耗增加，而不影响身体活动或呼吸交换比率。移植CD7+单核细胞的小鼠在iWAT中显示出更高的UCP1和PGC1α表达。免疫组化染色显示，UCP1染色在iWAT中显著增强，而在BAT中没有增强（图3A-3G）。

为探讨CD7+单核细胞是通过驻留在基底细胞中还是通过浸润脂肪组织发挥功能。CD7+和CD7-单核细胞在转移前DiR标记，以跟踪这些细胞在体内的运动轨迹。CD7+单核细胞倾向于定位于iWAT，而在BAT中积累较少，在附睾WAT (eWAT)中几乎没有积累。与CD7-单核细胞相比，趋化因子受体Gpr183的mRNA和蛋白水平在CD7+单核细胞中升高。CD7+单核细胞中敲除Gpr183，然后用PKH26标记并转移到受体小鼠中。Gpr183敲低CD7+单核细胞转染小鼠iWAT中的PKH26信号远低于对照CD7+单核细胞转染小鼠，表明Gpr183依赖性CD7+单核细胞优先迁移到iWAT（图3H-3N）。

图3 CD7+单核细胞优先迁移到iWAT

Result 4 诱导CD7+单核细胞耗竭可促进体重恢复

为了研究CD7+单核细胞在肥胖中的体内作用，研究者将R26CAG-LSL-RSR-tdTomato-2A-DTR 小鼠和Lyz2-Cre和 CD7-Dre 小鼠杂交，以实现白喉毒素(DT)给药后，表达DTR的 CD7+单核细胞的谱系追踪和基因消融。DT治疗CD7-Dre、Lyz2-Cre、R26tdT-DTR小鼠，在不影响BM免疫细胞组成的情况下，可以高效地消耗BM tdTomato+和相应的CD7+单核细胞。与PBS处理的小鼠相比，CD7+单核细胞缺失引起的体重恢复更快、更强劲，同时脂肪量增加。在高热量喂养期间，CD7+单核细胞的消耗减少了氧气消耗和寒冷适应能力的受损，却不影响食物摄入或活动。CD7+单核细胞缺失主要在iWAT中影响UCP1的表达，而在BAT中没有。综上所述，这些结果表明CD7+单核细胞对于控制体重恢复至关重要（图4）。

图4 诱导CD7+单核细胞耗竭可促进体重恢复

Result 5 CD7+单核细胞在营养胁迫下进行表观遗传适应

为了更深入地探索营养波动下CD7+单核细胞的特征，研究者对分离的CD7+单核细胞进行了ATAC-seq。结果表明，不同喂食模式之间的ATAC-seq peak是不同的。饮食转换引起的ATAC-seq peak变化与肥胖引起的峰值变化在很大程度上呈负相关。超过14000个peak是由高热量食物引起的，然后在节食后消失。这些peak相关基因在包括氧化应激在内的途径中富集，如Hif1a和Gapdh是BM中缺氧诱导的反应和无氧糖酵解至关重要，并在肥胖时迅速上调。在肥胖期间获得而在饮食转换后丢失的peak相关基因在DNA损伤和修复途径和炎症途径中富集。在HFD小鼠的CD7+单核细胞中建立了大约800个peak，在Cyc小鼠中进一步保持开放。这些peak相关基因在脂质代谢、细胞迁移以及干细胞维持中富集。整体描绘了CD7+单核细胞在解决炎症中的生态位-适应平衡（图5）。

图5 CD7+单核细胞在营养胁迫下进行表观遗传适应

Result 6表观遗传调控FGL2介导CD7+单核细胞对米色脂肪产热的影响

为了进一步描述CD7+单核细胞抵消体重反弹的机制，研究者联合分析了在波动营养应激期间ATAC-seq与scRNA-seq数据。鉴定了5个重叠基因(Fgl2, Tfrc, Dpp4, Nucb2和Serpinb1a)，且与CD7-单核细胞相比，这5个基因在CD7+单核细胞中mRNA水平更高。编码具有免疫抑制功能的FGL2表达量最高。基因型组织表达(GTEx)数据库分析显示，人FGL2基因在全血中的表达与CD7+单核细胞的标记转录因子KLF4的表达呈正相关。且与Klf4染色质可及性增加一致。与CD7-单核细胞培养上清相比，FGL2蛋白水平在CD7+单核细胞培养上清（条件培养基（CM））中高度富集。因此，研究者选择FGL2进行进一步的研究(图6A-6D)。

纤维介素蛋白(FGL2)重组蛋白（rFGL2）处理小鼠在iWAT中显著增强了产热基因（Ucp1, Ppargc1a, Dio2, Prdm16）和beiging-related基因(Cd137和 Tbx1)的表达。rFGL2处理激活了米色脂肪细胞中的PKA信号通路，而H89处理消除了这一作用，并抑制了UCP1表达上调。结果表明，FGL2可能通过促进米色脂肪产热而促进代谢。Fgl2△Lyz2小鼠（巨噬细胞特异性FGL2敲除小鼠）中分离的CD7+单核细胞的CM显著抑制了脂肪产热，补充rFGL2恢复了UCP1和PGC1a的表达。FGL2显著削弱了CD7+单核细胞的抗肥胖作用 (图6E-6G) 。

通过质谱分析、qPCR、免疫印迹分析，研究者选择验证FGL2是否能与米色脂肪细胞中的TMEM120A结合。研究者将FLAG-FGL2和HA-TMEM120A质粒转染到人胚胎肾(HEK) 293T细胞中，收集细胞裂解液进行共免疫沉淀(coIP)实验，结果证实FGL2可以与TMEM120A结合。用TMEM120A siRNA转染米色脂肪细胞，rFGL2处理后，cAMP-PKA信号的激活和下游产热基因(Ucp1和Ppargc1a)的表达均因TMEM120A缺失而受到抑制。因此证明FGL2结合TMEM120A促进米色脂肪细胞产热(图6H-6M)。

图6 表观遗传调控FGL2介导CD7+单核细胞对米色脂肪产热的影响

Result 7 FLT3配体刺激恢复CD7+单核细胞活力，从而抑制体重反弹

研究者探索了来自Cyc小鼠的BM免疫细胞是否可以在减肥后很长一段时间内防止肥胖。小鼠分别饲喂HFD 5周，然后切换为ND喂养3周(Cyc)， 6周(Cyc-6w)或10周(Cyc-10w)。与移植Cyc小鼠BM免疫细胞的小鼠相比，移植Cyc-6w和Cyc-10w小鼠BM免疫细胞的小鼠对肥胖进展和耗氧量的影响很小。Cyc-6w和Cyc-10w小鼠显示CD7+单核细胞占比降低。Cyc-6w和Cyc-10w小鼠分离的CD7+单核细胞的细胞周期进程被大大抑制，表明CD7+单核细胞在减肥后逐渐进入静止状态（图7A-7C）。

为了检测临床相关性，研究者招募了一组肥胖志愿者，通过节食成功减肥(至少10%)。体重减轻后，外周血中hCD7+单核细胞的频率随着时间的推移逐渐降低。那些成功维持10%以上体重减轻至少6个月的患者，其hCD7+单核细胞的比例高于体重恢复的患者。循环CD7+单核细胞的占比与减肥后6个月的体重恢复程度呈负相关。结果表明，在减肥后很长一段时间内唤醒CD7+单核细胞可能有助于对抗体重反弹（图7D-7F）。

Flt3是一种在造血发育中起重要作用的BM因子，因此推测Flt3配体(FLT3L)刺激可能使CD7+单核细胞恢复活力，从而恢复代谢稳态。首先检测了BM中FLT3L的水平，发现其表达在体重减轻后逐渐下降，同时CD7+单核细胞减少，无法控制肥胖。用FLT3L刺激Cyc-10w小鼠2周后，BM和循环中的CD7+单核细胞均增加。对Cyc、Cyc-10w和FLT3L刺激的Cyc-10w小鼠的CD7+单核细胞进行了ATAC-seq，5,880个peak在静止期丢失，并在FLT3L刺激下恢复。恢复peak相关基因参与氧化磷酸化(如Ndufa8和Cox5b)和干细胞稳态(如Klf4和Tfdp1)。Klf4和Fgl2转录起始位点附近的peak也被FLT3L重新激活，进一步证明了FLT3L刺激在再生CD7+单核细胞中的关键作用。FLT3L治疗成功地抑制了Cyc-10w小鼠在接受二次HFD喂养时的体重恢复。FLT3L刺激在Fgl2△Lyz2小鼠中仍然具有一定的肥胖抑制作用。但是在没有CD7+单核细胞的情况下，FLT3L刺激不再对体重恢复有抑制作用。这些结果表明，FLT3L刺激使CD7+单核细胞恢复活力，从而抑制体重反弹（图7G-7K）。

图7 FLT3配体刺激恢复CD7+单核细胞活力，从而抑制体重反弹

本文研究人员通过对ND、HFD和Cyc组小鼠的BM免疫细胞进行scRNA-seq，发现了一种干细胞样的CD7+单核细胞亚群，它们在节食引起的体重减轻的小鼠和人类骨髓中聚集。CD7+单核细胞的过继转移可抑制体重反弹，而CD7+单核细胞的诱导性消耗则会加速体重反弹。这些细胞通过表观遗传适应积累了新陈代谢记忆，优先迁移到皮下白色脂肪组织，并在那里分泌FGL2，激活PKA信号通路，进而促进米色脂肪产热。CD7+单核细胞在减肥后会逐渐进入静止状态，同时体重增加。值得注意的是，服用FLT3L能显著恢复CD7+单核细胞的活力，从而改善体重快速反弹的情况。研究结果发现了一种独特的骨髓源性代谢记忆免疫细胞群，可以作为防治肥胖症的靶标。

参考文献

Zhou HY, Feng X, Wang LW, et al. Bone marrow immune cells respond to fluctuating nutritional stress to constrain weight regain [J]. Cell Metabolism, 2023. DOI: 10.1016/j.cmet.2023.08.009.