摘要

黑色素瘤是一种高度恶性的皮肤肿瘤，侵袭性强，预后差。1美国国家癌症研究所估计，2020 年美国将有大约 100,000 例新的黑色素瘤病例和 6850 例死亡。2黑色素瘤的危险因素包括浅肤色、紫外线照射、痣、遗传易感性和黑色素瘤家族史. 2进入21世纪以来，对黑色素瘤治疗的研究，尤其是免疫检查点抑制剂和BRAF抑制剂的发现，极大地提高了黑色素瘤患者的生存率。3 , 4然而，虽然黑色素瘤患者的死亡率在下降，但黑色素瘤的发病率仍在逐年上升。5同时，PD-1/PD-L1抑制剂和BRAF突变抑制剂的耐药性也逐渐显现，这使得探索新的生物标志物迫在眉睫。6

Pyroptosis 是一种程序性细胞死亡的炎症形式，与细胞凋亡有许多相似之处，但也存在显着差异。7细胞发生焦亡时，细胞膜上会出现许多孔洞，使细胞发生渗透性肿胀和破膜，炎性物质排出，引起明显的炎症反应。7这是细胞焦亡的形态特征。早在 1992 年，Zychlinsky 等就观察到福氏志贺菌可以在宿主巨噬细胞中诱导这种死亡，但由于当时的知识有限，仍被认为是细胞凋亡。8直到 2001 年，Cookson 等人才发现这种死亡不同于细胞凋亡，具有 Caspase-1 依赖的特征，这才促使他们首次将其命名为“细胞焦亡”。9 “Pyro”意为“火”，“ptosis”意为“坠落”，形象地描述了这类死亡的特征。根据细胞焦亡机制的不同，可分为Caspase-1介导的经典焦亡途径和Caspase-4/5/11介导的非经典焦亡途径。10活化的半胱天冬酶切割 Gasdermin 蛋白以形成 N 端结构域 (GSDM-N) 和 C 端结构域 (GSDM-C)。11GSDM-N 具有成孔活性，并被“寡聚化”以在细胞膜上形成大小不一的孔，介导细胞的渗透肿胀和炎症分子如 IL-1β 和 IL-18 的排出。7焦亡是癌症的一把双刃剑。一方面，我们可以诱导肿瘤细胞焦亡以抑制肿瘤生长。另一方面，细胞焦亡过程中释放的炎性物质形成肿瘤的炎性微环境，通过激活不同的信号通路促进肿瘤生长。12细胞焦亡与癌症之间的相关性仍需要进一步研究来阐明。其中，细胞焦亡与黑色素瘤的相关性尚不清楚。

距离 Jacob 和 Monod 发现 mRNA 已有 60 年了。13他们的重大发现为“遗传中心法则”奠定了基础。14直到今天，“遗传中心法则”仍然是遗传学的经典法则。但在 2001 年，人类基因组计划发现只有 1.5% 的核酸序列被转录成 mRNA 来编码蛋白质，而剩下的 98.5% 通常被认为是“垃圾序列”。15随着研究的发展，人们发现这些“垃圾序列”可以转录成多种非编码RNA。LncRNA就是其中之一，通常是指具有200多个核苷酸序列的非编码RNA转录本，在体内平衡调控和肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。16目前，许多研究已经证实了lncRNA与细胞凋亡的关系，但具体的作用网络仍不清楚。

在这项研究中，我们探索了黑色素瘤中与细胞焦亡相关的 lncRNA，并构建了一个预后模型，该模型显示高风险评分的患者预后较差。我们的结论可为黑色素瘤的预后和治疗提供一些新的思路

结果

流程图如图所示 图1. 首先，我们从 TCGA 数据库下载黑色素瘤数据。然后，我们构建了一个基于 9 个与细胞焦亡相关的 lncRNA 的预后模型。随后，我们研究了高危组和低危组之间免疫浸润和 m6A 甲基化的差异。最后，我们进行了 GSEA 分析。

鉴定了九个与焦亡相关的 lncRNA 以计算风险评分

首先，通过Pearson相关检验鉴定了与黑色素瘤细胞焦亡相关基因密切相关的lncRNA。对TCGA数据库中黑色素瘤细胞焦亡相关lncRNA进行Cox回归和Lasso回归，最终得到9条具有预后价值的细胞焦亡相关lncRNA。表格1）。通过这 9 个 lncRNA 计算风险评分。根据中位风险评分，将 457 名 TCGA 的黑色素瘤患者分为高危组和低危组。图 2A）。

基于风险评分的分组模型可有效预测黑色素瘤患者的预后

在将黑色素瘤患者分为高危组和低危组后，我们进行了生存分析。从图中可以看出图 2B，高危组患者生存率明显下降，差异有统计学意义（P<0.001）。在图 2C，以点图的形式，我们可以直观地看到高危组患者的生存时间集中在底部，即生存时间较短。 图 2D热图反映了 9 个细胞焦亡相关 lncRNA 的表达状态与 TNM 分期、性别和年龄等临床特征之间的关系。热图显示高危组和低危组患者的 T 分期存在显着差异。其他临床特征无显着差异。

风险评分是影响患者生存的独立因素，准确度高

为了探讨风险评分是否是黑色素瘤患者的独立影响因素，对风险评分、年龄、性别、TNM分期等因素进行单变量和多变量Cox回归。数据库中患者的临床特征如下（表 2）。单因素 Cox 回归显示，年龄、分期、T 分期、N 分期和风险评分是黑色素瘤患者预后的独立影响因素。图 3A）。多因素 Cox 回归显示 T 分期、N 分期和风险评分是黑色素瘤患者预后的独立影响因素。图 3B）。ROC曲线显示风险评分的AUC值为0.821，表明其敏感性（图 3C）。Nomogram 可以看到风险评分与 1、3 和 5 年生存率相关（图 3D）。校准表明，Nomogram 可以准确预测黑色素瘤患者的 1、3 和 5 年生存率（图 3E）。

不同人群免疫检查点与M6A甲基化的相关性分析

许多免疫检查点基因在两组样本中的表达不同，并且在低风险组中往往更高（***P<0.001， 图 4A）。在高危组和低危组样本中，7个M6A甲基化相关基因的表达存在差异，且均在低危组呈上调趋势（***P<0.001；* P < 0.05；图 4B）。

不同组别免疫细胞浸润水平分析

通过TIMER、CIBERSORT、Quantiseq等算法计算高危组和低危组的免疫浸润水平。热图显示了不同算法下两组患者肿瘤微环境中各个免疫细胞浸润的水平（图 4C）。我们可以看到，低风险组倾向于在肿瘤微环境中拥有更高水平的免疫细胞。

不同组别抗肿瘤药物敏感性差异分析

研究不同人群对抗肿瘤药物的敏感性，可以为未来治疗方案的制定提供帮助。高危人群对某些药物更敏感，例如贝沙罗汀、苔藓他汀和多西他赛。图 5A）。低危组对硼替佐米、博舒替尼、喜树碱等较敏感（图 5B）。这对我们根据群体情况选择药物具有指导意义。

基因集富集分析

为了探索高风险和低风险组之间基因表达的功能差异，我们进行了 GSEA 分析。结果表明，高危组基因表达主要与ECM-受体相互作用、癌症信号通路和自噬有关。图 6A和和Bc）。

讨论

细胞死亡的方式一直是研究的重点。由于癌细胞具有无限增殖的能力，诱导癌细胞死亡已成为潜在的治疗方向。17程序性细胞死亡 (PCD) 包括细胞凋亡、细胞焦亡和铁死亡。其中，细胞焦亡在治疗癌症方面具有巨大潜力。18细胞焦亡在癌症中起着双重作用。一方面，我们可以通过诱导癌细胞焦亡来减轻肿瘤负荷；另一方面，癌细胞的细胞焦亡可导致炎性物质的排出，从而构建肿瘤的炎性微环境，为肿瘤的生长提供条件。7 目前，细胞凋亡在包括黑色素瘤在内的癌症生理学中的作用仍不清楚。

LncRNA是一类核苷酸数大于200的非编码RNA。已知研究表明，lncRNA在炎症、肿瘤形成和耐药性的获得中发挥着重要作用。19许多研究已经证实 lncRNA 参与细胞凋亡，但它们在黑色素瘤细胞凋亡中的作用机制知之甚少。

在本研究中，我们探索了与黑色素瘤细胞焦亡相关的 lncRNA，并确定了具有预后价值的 lncRNA。通过 Cox 回归和 Lasso 回归，我们构建了一个由 9 个 lncRNA 组成的预后模型。通过计算风险评分，457 名患者被分配到高风险或低风险组。与低危组相比，高危组生存率显着降低，差异有统计学意义（P<0.001）。ROC曲线和校准曲线证明了预后模型的准确性。不仅如此，我们发现免疫检查点相关基因和M6A甲基化相关基因的表达水平在低风险组中更高。

对于黑色素瘤这种预后较差的肿瘤，建立有效的预后模型并探索其作用机制可以提高治疗效果。目前，免疫检查点抑制剂和靶向抑制剂在黑色素瘤中取得了良好的治疗效果。但这些治疗方法会逐渐产生抵抗力，给患者带来遗憾。20细胞焦亡是治疗黑色素瘤的一个有希望的新方向。GSDME是细胞焦亡途径中的关键蛋白，在许多癌细胞中不表达，但在黑色素瘤中高表达，成为黑色素瘤的致命弱点。21诱导黑色素瘤细胞焦亡可能在改善晚期黑色素瘤的预后中发挥潜在作用。22Yu 等人 发现黑色素瘤中的自噬与细胞焦亡密切相关，焦亡是由 EEF-2K 介导的过程。23 Erkes 等人还发现 BRAF 和 MEK 抑制剂可以通过诱导黑色素瘤细胞焦亡来改变肿瘤微环境，从而改善预后。24由此可见，细胞凋亡与黑色素瘤之间存在密切的相关性，具有很大的探索前景。

黑色素瘤是一种高度免疫相关的肿瘤，免疫检查点抑制剂的发现是一个里程碑。25 CTLA-4 和 PD-1 抑制剂的临床应用使许多黑色素瘤患者受益，大大提高了黑色素瘤患者的无病生存期和总生存期。26探索细胞焦亡和免疫检查点之间的串扰可以进一步帮助我们了解细胞凋亡的临床意义。根据我们的结果，免疫检查点相关基因的表达在低风险组中更高，这表明免疫检查点抑制剂治疗可能对低风险组更有益。

表观遗传学存在于广泛的生物体中，转录后修饰是一种常见的调控途径。27 M6A-甲基化是真核生物中最常见的转录后修饰。28该过程由甲基化酶（写入器）、去甲基化酶（擦除器）和甲基化阅读蛋白（读取器）介导，参与生物体的稳态调节和疾病的发生发展。29细胞中 M6A 甲基化的调控也成为治疗疾病，尤其是肿瘤的新思路。29通过对细胞焦亡相关lncRNA和M6A甲基化相关基因的相关性分析，我们发现低危组的甲基化水平往往更高，这为未来治疗黑色素瘤的M6A甲基化提供了思路。同时，也间接表明焦化与M6A甲基化之间存在一定程度的串扰。

总而言之，我们的研究建立了黑色素瘤患者焦亡相关 lncRNA 的预后模型，并研究了其作用机制。这不仅对指导预后有意义，而且可以促进黑色素瘤的肿瘤生理学研究，例如免疫检查点和M6A甲基化。然而，我们的研究有一些局限性。我们缺乏体内和体外实验来验证 lncRNA 在预后模型中的表达和功能，我们将在未来改进这方面。

结论

我们的研究建立了黑色素瘤患者细胞焦亡相关lncRNAs的预后模型，为黑色素瘤细胞焦亡的研究提供参考，为黑色素瘤的治疗提供新思路。但由于缺乏验证，我们的研究存在一些局限性。

方法

数据集的信息提取

从数据库中的 TCGA ( https://portal.gdc.cancer.gov/ ) 下载的黑色素瘤 RNA 测序数据。纳入标准为：（1）确诊为黑色素瘤的患者；(2)患者有详细的lncRNA和临床信息。共有 457 名黑色素瘤患者符合纳入标准，下载了他们的 lncRNA 和临床信息（排除了随访时间少于 30 天的患者）。

鉴定与细胞焦亡相关的 lncRNA

从以前的文献中获得了 33 个凋亡相关基因。Pearson相关方法用于鉴定与细胞焦亡相关的lncRNA。相关系数 R 2 >0.3 和 P<0.001 被认为是细胞焦亡相关的 lncRNA。我们使用 Cytoscape 软件来可视化 lncRNA 共表达网络。

预后性焦亡相关 lncRNA 的鉴定

首先，我们对细胞焦亡相关的 lncRNA 进行了单变量 Cox 回归。我们使用 R 软件中的包“forestplot”进行 COX 回归分析。然后对lncRNA进行Lasso回归，P<0.05，对得到的结果进行多变量Cox回归。根据最终结果计算风险评分。使用回归系数（β），评分公式为：

。使用中位风险评分，将患者分为高风险组和低风险组。

预后模型的构建

将患者分为高危组和低危组后，对两组进行Kaplan-Meier生存分析，以确定模型的预后价值。通过校准曲线和ROC曲线验证所建立的预后模型的准确性。我们使用 R 软件中的“plotROC”包来绘制 ROC 曲线。

已建立的预后模型的临床价值

我们分别使用单变量和多变量 Cox 回归来测试风险评分和临床特征（年龄、性别、分期）是否是黑色素瘤患者的有效预后指标。列线图用于展示有关 1、3 和 5 年生存率的临床特征和风险评分。

免疫检查点与M6A-甲基化的相关性分析

然后，我们通过阅读已发表的文献收集了 47 个免疫检查点相关基因 (ICP) 和 25 个 M6A 甲基化相关基因，并在两个数据集中研究了这些基因在高风险和低风险人群中的表达。保留差异表达的ICP和ICD基因（P <0.05）并显示为条形图。组间比较采用秩和检验。

预测黑色素瘤潜在候选药物的模型

通过使用“pRRophetic”包和黑色素瘤患者的表达矩阵，我们预测了黑色素瘤患者药物的最低药物抑制浓度（IC50），最终得到了一些与模型相关的可能成为治疗黑色素瘤候选药物的药物。黑色素瘤。

基因集富集分析

基因集富集分析(GSEA) 是一种计算方法，可确定先验定义的基因集是否在两种生物状态（例如表型）之间显示出统计学上显着的一致差异。我们使用 GSEA 分析来探索高风险和低风险组之间基因功能的 KEGG 途径差异。