养细胞tips

擦台子（先擦自己面前的） +擦枪

操作基础常识：

吹散细胞：就是用枪吸打吸打

粗准焦螺旋调节：对准到不同层的细胞

不同孔板的量：12孔板装2mL或1mL培养基；96孔板装100微升培养基。

不同培养皿的量：小培养瓶要4-5mL培养基；培养皿要6,7,8ml培养基（大皿相当于三四个小瓶）

胰酶用量：小瓶1ml胰酶，大瓶2mL胰酶消化

①培养基配制：

1）10ml胰酶消化液=1ml胰酶+0.5mlEDTA+8.5mlPBS

实际操作：用滤膜过滤后的EDTA（2mL），胰酶(4mL)各拿一管配到40mL

2）10％的胎牛血清+1％的双抗（青霉素和链霉素）

eg.50mL细胞培养基：

5mL血清+500微升双抗+拿培养基加到五十毫升即可

②复苏：

1）巨噬细胞-DMEM培养基

去掉细胞冻存液：冻存液一管是1mL，加DMEM后1mL变成2mL再离心，巨噬细胞离心1000转3min。可以直接离心完从细胞的那面倒掉。

③铺板：

晃动培养器皿前后各十次混匀

1）巨噬细胞：不用胰酶消化，直接吹打。不要老是对着一个地方吹，扫吹。

2）B16F10黑色素瘤细胞：在瓶中的要1mL胰酶消化用1mL培养基中和后铺板（事先可以1mL胰酶/PBS洗一下，晃一下就可以），在显微镜下观察细胞变圆，有点小空隙（但不能飘），大概半分钟的样子（根据实际情况摸索）。

④换液：培养皿变黄时换液。

△倒掉液体的时候一定要把皿边上残留的液体用酒精棉擦干净，否则接缝处易染菌。

△枪头不要对准细胞，对准培养皿的壁加，防止冲下细胞。因为巨噬细胞容易被冲散。

⑤加细胞因子：细胞因子50ng/mL

把细胞因子IL-4和LPS加到培养基里再给细胞加。

 PS：50ug的粉末（3000元）

⑥MTT：MTT 0.5mg/mL

96孔板 （N=5）100微升血清 

△记得枪不要对着细胞，贴着孔壁吸取液体。

eg. 三分之一瓶细胞铺一块96孔板（5*8左右，中间一小块）

⑦极化巨噬细胞：12孔板 （N=3） 孵育24h

《流式之前的染色》

在板里吸掉培养基后加PBS吹打再离心去掉PBS

1微升抗体+100微升PBS （是含0.1%BSA的PBS）加到细胞里孵育10-15min，洗两遍。

加100微升多聚甲醛泡15-20mn离心掉

扩展：骨髓原代细胞提取出来之后用集落刺激因子刺激后才分化成DC细胞（此时可能会有团聚现象）