类器官培养天坑三之组织消化如何避坑？

类器官养不好，活性是根本，消化是起点，有多少同学老师掉进过起点的坑？

您是否把几种胶原酶组合一下，就认为可以消化好组织？

您是否买一款消化液消化到单细胞，迟迟等不到类器官生长？

您是否辛苦消化完，鉴定不到活细胞，更是看不到活着的类器官？

您是否消化后，获得的高粘性的上清，过滤不到细胞？ 

类器官培养步步惊心，有多少人倒在了消化坑边。小桢介绍过保护液来保护组织活性的重要性，但是如果消化不好，一样前功尽弃。针对类器官构建，目前以胶原酶消化为主，如何高效的消化组织且能有效保持细胞活性一直都是类器官构建上一个难题。有些消化液消化效率非常高，但是容易把组织块消化成单细胞，很难生长成类器官。更有甚者直接破坏细胞，导致细胞内容物释放，上清无法通过滤网，得不到能够用于类器官培养的细胞团。

有没有一款消化液，可以弥补以上问题？

伯桢生物针对于类器官构建量身定制的肿瘤组织消化液（货号K601003）/正常组织消化液（货号K601008），成功逆袭。

伯桢研发团队通过溯源组织发育逻辑，解析组织成分，针对性调整胶原酶配方，提高组织消化效率的同时，避免细胞损伤，并添加了保护组织活性成分，开发出针对类器官的消化液。该消化液可以实现在保护组织活性的同时，高效的消化组织团块，使其快速达到构建类器官的标准大小（3~5个细胞组成的细胞团。）

 快问快答

1.这个肿瘤消化液所有肿瘤都适合？

是的！这个是一款肿瘤通用消化液，主要以消化时间调整来适配各种肿瘤，比如一些间质比较多的肿瘤（胰腺癌）消化时间就适当需要延长，如果是一些比较松散的肿瘤消化时间就适当缩短。

2.到底消化到什么样子比较合适?消化的时间怎么判断？

•一般情况下，样本的消化时间在30-120分钟之间（穿刺样本在10分钟甚至更短），建议20分钟以后，每隔10分钟镜检一次（取10μL消化液于培养皿中，在显微镜下观察是否消化下来细胞团）；

•消化至溶液中的细碎组织可以通过1mL的无菌吸头。消化期间可以使用不同规格（顺序从大到小如10mL，5mL，1mL）的移液管吹打组织消化悬液，帮助充分消化。

注：建议初学者设置时间梯度实验，针对不同癌种，甚至是不同患者的组织标准，通过时间梯度实验，摸索适合自己的消化时间。

3.过滤时为什么有的组织是用70um细胞筛，有的是用100um细胞筛？

正常组织的干细胞团块比较小，70um细胞筛就好了，肿瘤组织的干细胞团块比较大需要用到100um细胞筛才可以。

4.怎么减少原代细胞团块的损失？

•在用100μm细胞筛（肿瘤组织）/70μm细胞筛（正常组织）过滤细胞悬液时，可以使用枪头适当研磨组织碎片，提高回收效率。
•在用100μm细胞筛（肿瘤组织）/70μm细胞筛（正常组织）过滤细胞悬液后，可使用1mL基础培养基（上皮类器官基础培养基（货号：B213151）；肿瘤类器官基础培养基（货号：B213152））冲洗用于消化组织的离心管，后再次过滤。
•离心时候推荐使用水平离心机，角转子离心机，会因为受力不均导致有些细胞过度贴壁甚至破损，影响回收。

5.我看nature protocol有的用胶原酶法，有的用EDTA法我应该如何选择？

•胶原酶法：胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适用于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。
优势：上手比较简单。
劣势：虽对活性有保护，但是还有一定损伤。（只能做到尽可能把损伤做到最小）

•EDTA：一些组织细胞，尤其是上皮组织细胞，在生长过程中需Ca2+ 和Mg2+参与细胞间连接，维持组织的完整性，EDTA从细胞生存环境中夺取Ca2+和Mg2+，并与这些离子形成螯合物，从而使细胞分离。
优势：对组织活性几乎没有损伤。
劣势：上手难度高。（比如小鼠小肠EDTA消化吹打后陷窝脱落，非常考验技术，操作的好，获得陷窝多，操作不好，很难获得隐窝）