FOXM1被USP21去泛素化可以调节基底样乳腺癌的细胞周期进程和紫杉醇敏感性

写在前面

        今天推荐的是由美国北卡罗来纳大学教堂山分校在2019年3月20日发表于Cell Reports（2020IF：9.423，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Michael J. Emanuele教授，研究表明FOXM1被USP21去泛素化可以调节基底样乳腺癌的细胞周期进程和紫杉醇敏感性。

研究背景

        转录因子FOXM1有助于细胞周期进程，并在基底样乳腺癌(BLBC)中显着上调。尽管它在正常和癌细胞周期中很重要，但现今对调节FOXM1的机制缺乏完整的了解。

摘要部分

        作者在基于RNAi的筛选中鉴定了USP21，一种用于控制FOXM1丰度的去泛素化酶。USP21增加了FOXM1的稳定性，USP21在体内和体外结合和去泛素化FOXM1，表明存在直接的酶-底物关系。敲低USP21会下调FOXM1转录并导致细胞周期进程的显着延迟。值得注意的是，USP21敲低使BLBC细胞系和小鼠异种移植肿瘤对紫杉醇敏感（紫杉醇是BLBC治疗中的一种抗有丝分裂的药物）。USP21是BLBC患者肿瘤中最常高表达的去泛素化酶，其高表达与FOXM1蛋白的上调同时发生。总之，这些数据表明USP21在FOXM1高、USP21高BLBC的增殖和治疗中的作用。

研究内容

1.USP21结合并改变FOXM1丰度     

        对HeLa细胞的免疫印迹（IB）分析显示，FOXM1的丰度随着PR-619（一种小分子、非特异性泛DUB抑制剂）浓度的增加而明显下降。这表明FOXM1的降解可以被DUBs主动阻止。用不同DUBs siRNA转染HeLa细胞，随后通过IB分析显示USP21敲低可降低内源性FOXM1的水平。相应地，USP21的异位表达明显增加了293T细胞中FOXM1的丰度。这些结果表明，FOXM1的丰度受USP21的调节。

        为了确定USP21表达的变化对FOXM1稳定性的影响是否是由于这两种蛋白之间的相互作用，作者在293T细胞中异位表达FLAG或HA标记的FOXM1b和Myc-USP21质粒。针对Myc-USP21或HA-FOXM1b都能通过共免疫沉淀（co-IP）检测到FOXM1和USP21之间的相互作用。此外，使用针对USP21的抗体检测了内源性FOXM1和USP21之间的相互作用。为了确定USP21识别的FOXM1的结构域，将一系列Myc-FOXM1b片段与FLAG-HA-USP21共同转染到293T细胞，并通过共同IP评估相互作用。针对Myc-FOXM1b和FLAG-HA-USP21的IP结果表明，USP21与包括FOXM1氨基酸321-400的区域结合。

研究结论：USP21和FOXM1直接相互作用，这两种蛋白质之间存在酶-底物关系。

2.FOXM1是USP21底物     

        为了确定USP21敲低或过表达对FOXM1的影响是否是通过蛋白酶体降解介导的，用蛋白酶体抑制剂MG132处理HeLa细胞。IB分析证实，USP21敲低导致的FOXM1不稳定部分通过蛋白酶体抑制得以恢复。DUB通过去除多聚泛素链，特别是K48和K11拓扑结构来对抗蛋白酶体降解。为了确定USP21是否影响FOXM1上的多聚泛素链缀合，作者在体内分析了FOXM1泛素化。293T细胞用HA-FOXM1b和6xHIS-FLAG-泛素结合WT USP21或USP21的催化失活变体（USP21 C221A）转染。通过IB进行分析表面，多泛素化的FOXM1在具有内源性USP21表达水平的条件下很容易检测到。然而，当USP21 C221A过表达时，多泛素化FOXM1的水平恢复到接近在对照条件下观察到的水平。

        因为USP21可以直接结合和去泛素化FOXM1，作者接下来评估了USP21对FOXM1稳定性的影响。为了评估USP21对FOXM1半衰期的影响，在293T细胞中过表达USP21 WT或USP21 C221A以及在BLBC MDA-MB-231细胞中敲低USP21以阻止蛋白质翻译后，通过IB评估FOXM1水平。在放线菌酮处理后的前4小时内，FOXM1丰度以相似的动力学下降，但USP21 WT过表达可以保护剩余群体免于降解至少12小时，而USP21 C221A细胞中的FOXM1丰度下降速度甚至比对照组细胞更快。

研究结论：USP21控制FOXM1泛素化和蛋白酶体介导的降解。

3.USP21影响FOXM1转录网络和增殖     

        FOXM1是一组基因的主要转录调节因子，这些基因参与建立和确保通过有丝分裂成功的G2/M过渡和进展。这种转录网络的失调已被证明会导致细胞周期延迟、有丝分裂缺陷和染色体错误分离。鉴于以上发现，作者认为调节USP21水平会对FOXM1转录输出产生相应的影响。作者将293T细胞与USP21和基于FOXM1荧光素酶的转录活性报告基因（6x-DBE）共转染。与对照相比，USP21过表达显着增强了FOXM1依赖性转录活性，表明USP21过表达增强了FOXM1丰度。相应地，在siRNA转染以敲低MDA-MB-231细胞中的FOXM1或USP21后，与对照相比，USP21的敲低导致所有FOXM1转录目标减少。此外，在用pINDUCER20慢病毒转导以引入强力霉素诱导的USP21转基因的MDA-MB-231细胞中，USP21过表达并未显着改变FOXM1 mRNA水平。总之，这些数据表明由于USP21引起的FOXM1水平变化对FOXM1转录网络具有下游影响。

        作者接下来试图确定有丝分裂进入的动力学是否会因USP21丢失而受到干扰。结果表明FOXM1或USP21的敲低显着损害了细胞周期进展为有丝分裂释放后22小时，在FOXM1和USP21敲低的群体中，分别只有1.6%和10.9%的细胞呈P-H3阳性。相比之下，有40.7%的对照细胞已经进入有丝分裂。在USP21敲低的FOXM1过表达群体中，有丝分裂发生得到显着恢复。这些结果证实了先前的报道，即FOXM1敲低会损害有丝分裂发生。最后，作者假设FOXM1和USP21敲低导致的有丝分裂发生减慢会导致增殖相应减少。数据也表明BLBC细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231的增殖显着受损。此外，在MDA-MB-231细胞中FOXM1b的异位、多西环素诱导表达部分地恢复了由USP21敲低引起的增殖受损。

研究结论：USP21的下调可以通过下调FOXM1稳定性和FOXM1转录网络的下游效应来影响整体增殖。

4.USP21扩增与BLBC中的FOXM1蛋白水平和肿瘤增殖相关

        FOXM1上调已在各种癌症中报告。在乳腺癌中，作者发现FOXM1 mRNA表达与乳腺癌亚型显着相关，在BLBC亚型中表达最高。作者接下来分析了FOXM1被激活的肿瘤的增殖能力。单个肿瘤的增殖评分与FOXM1表达高度显着相关，因此作者得出结论，仅FOXM1水平增加是肿瘤增殖的有力指标。接下来，作者分析了癌症基因组图谱(TCGA)数据集中乳腺肿瘤中所有人类DUB的拷贝数变化和mRNA表达。USP21扩增与增殖评分和BLBC亚型均显着相关。相应地，对代表正常样、管腔和BLBC乳腺癌亚型的细胞系中FOXM1和USP21蛋白表达的IB分析显示，FOXM1和USP21的表达在BLBC亚型中是独特的。FOXM1是TCGA中通过反相蛋白质阵列(RPPA)分析的227种蛋白质之一。这为作者提供了检查乳腺癌中FOXM1蛋白水平的丰度及其与肿瘤中USP21 mRNA表达的关系的机会。因为作者的结果表明FOXM1蛋白被USP21翻译后稳定，作者检查了FOXM1蛋白水平作为USP21表达的函数。结果FOXM1蛋白是USP21扩增肿瘤中最显着上调的蛋白。作者还使用基因集富集分析(GSEA)探究了114个FOXM1靶基因的精选列表是否与USP21扩增相关。该分析揭示USP21扩增的乳腺癌中FOXM1转录网络的强烈富集。

研究结论：USP21扩增与BLBC中的FOXM1蛋白水平和肿瘤增殖相关。

5.USP21影响BLBC中的紫杉醇反应       

        除了在癌症增殖中的作用外，FOXM1的高表达还归因于乳腺癌对铂类药物和紫杉类的抗性并与转移和患者预后不良相关。作者探究了USP21敲低是否可以以FOXM1依赖性方式增加对紫杉醇的敏感性。几种BLBC细胞系细胞被用来评估对照组（siFF）、FOXM1敲低组和USP21敲低组细胞暴露于DMSO或紫杉醇72小时后的生存能力。在所有被评估的细胞系中，与未用紫杉醇处理的细胞相比，用紫杉醇处理的FOXM1和USP21敲低条件的存活率明显下降。因此，虽然在对照条件下USP21（和FOXM1）的敲低会损害这些细胞系中的每一个的增殖，但当USP21敲低与紫杉醇治疗相结合时，存活率在统计学上显着降低。考虑到当单独用紫杉醇处理时SUM149细胞的生存能力没有显着降低，这尤其引人注目。FOXM1敲低和USP21敲低导致细胞活力的显着差异以及当FOXM1在USP21缺失条件下过表达时细胞活力的显着恢复表明FOXM1显着促进紫杉醇敏感性并且是关键的USP21底物，导致在USP21敲低细胞中观察到的紫杉醇敏感性差异。

        基于USP21的敲低使细胞对紫杉醇敏感的认识，作者接下来探究BLBC细胞在小鼠异种移植模型中被USP21敲低后对紫杉醇的反应如何。SUM149是一种BLBC细胞系，在小鼠异种移植物中对紫杉醇不敏感。作者用表达对照shRNA或shUSP21的慢病毒转染SUM149细胞，并植入NOD-SCID小鼠的乳腺脂肪垫中，然后每周两次给小鼠施用紫杉醇或药物。结果显示，由于USP21敲低和紫杉醇，平均肿瘤体积在六周内从对照条件下的1,101 mm3减少到414 mm3。

研究结论：抑制USP21可能通过抑制增殖和增强由FOXM1激活驱动的化疗耐药效应，起到BLBC的治疗效果。

结论与讨论

        在这里，作者展示了FOXM1和USP21之间的底物-酶关系。USP21调节FOXM1的丰度，结合并去除FOXM1的多聚泛素链，从而保护其免受蛋白酶体降解。作者还表明USP21表达可以改变FOXM1转录网络，这对调节有丝分裂时间和增殖有影响。此外，结果显示，FOXM1和USP21在BLBC中被特异性上调，并且USP21的敲低可以提高对紫杉醇的敏感性，这主要是通过其与FOXM1的关系。因此说明，USP21通过维持FOXM1的稳定性来调节细胞周期进程，并且抑制USP21在治疗具有FOXM1高、USP21高表达特征的BLBC方面具有治疗潜力。

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原文链接：

https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2211124719302335