急性T淋巴细胞白血病中USP7去泛素化并稳定NOTCH1

写在前面

        今天推荐的是由上海交通大学医学院团队在2018年10月26日发表于Signal Transduct Target Ther（IF：9.683，JCR 1区）的一篇文章，通讯是Yingli Wu教授，研究表明USP7是一种稳定NOTCH1的新型去泛素酶，并且可能是T-ALL的治疗靶点。

研究背景

        T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)具有高度侵袭性，主要由NOTCH1信号通路的异常激活引起。NOTCH1是一种跨膜蛋白，其被激活后会释放NOTCH1的胞内结构域(ICN1)。作为配体激活的转录因子，NOTCH1调节多种细胞事件，包括细胞增殖、存活、转移和分化。

        先前研究表明，泛素化调控NOTCH1的稳定性、活性和定位。eIF3f已被报道作为一种去泛素酶调节NOTCH1的激活，但调节NOTCH1蛋白稳定性的去泛素酶尚不清楚。USP7通过其去泛素化活性可以影响底物的定位、活化和稳定性。在肝细胞癌、乳腺癌和卵巢癌等多种癌症中均检测到USP7的过表达，抑制USP7可以抑制癌细胞的增殖并诱导癌细胞死亡。

摘要部分

        在这里，作者报道了泛素特异性蛋白酶7(USP7)通过去泛素化作用维持NOTCH1稳定。在T-ALL细胞中，USP7与NOTCH1相互作用。在体内外，USP7的缺失显著抑制T-ALL细胞的增殖，并伴随着NOTCH1蛋白水平的下调。同样，药物抑制USP7可导致T-ALL细胞凋亡。作者还发现USP7在人类T-ALL细胞系和患者样本中显著上调，并且一种USP7抑制剂对原代T-ALL细胞表现出细胞毒性。总体而言，作者的研究表明USP7是一种稳定NOTCH1的新型去泛素酶，它可能是T-ALL的一个治疗靶点。

研究内容

1.USP7维持ICN1稳定     

        作者在HEK293T细胞中过表达22个USPs并分析内源性ICN1的蛋白水平。筛查显示，USP7显著上调了ICN1的蛋白水平。此外，催化失活的USP7突变体(USP7C223S)无法上调ICN1，表明USP7对ICN1的调节依赖于其DUB活性。

        接着作者发现，P22077（USP7抑制剂）处理T-ALL细胞系(JURKAT、MOLT-4等)后，ICN1蛋白水平呈剂量依赖性降低，但未改变其mRNA水平。另一方面，蛋白酶体抑制剂MG132阻断了P22077诱导的ICN1下调。

研究结论：去泛素酶USP7控制NOTCH1蛋白的稳定性。

2.USP7与ICN1相互作用     

        作者通过免疫沉淀探究USP7是否与ICN1相互作用。结果发现异位表达的Myc-ICN1与FLAG-USP7相互作用。进一步实验表明USP7与ICN1之间存在直接相互作用。此外，免疫荧光表明USP7和NOTCH1共定位于细胞核。

        实验表明，USP7通过其N端MATH结构域和C端UBL结构域与ICN1相互作用。其中，UBL结构域足以与ICN1结合，然而USP7的催化结构域本身不能与ICN1结合。

研究结论：USP7在体内外都与ICN1相互作用，并且USP7的MATH结构域和UBL结构域介导了这种相互作用。

3.USP7去泛素化ICN1     

        作者发现ICN1与野生型USP7的共表达降低了泛素化ICN1的蛋白水平。同样，P22077对USP7的抑制完全阻断了USP7对ICN1的去泛素化。值得注意的是，缺少MATH或UBL结构域的USP7突变体无法从ICN1中移除泛素。

        作者将HA-泛素和Myc-ICN1质粒共转染293T细胞，结果发现下调USP7后泛素化ICN1的蛋白水平增加。另外，体外去泛素化实验显示，纯化的USP7显著降低了ICN1的泛素化水平。

研究结论：ICN1是去泛素酶USP7的直接底物，USP7介导ICN1的去泛素化。

4.USP7在T-ALL中过表达

        作者分析了USP7在一系列人类癌细胞系中的转录表达，发现USP7在T-ALL中高表达。有趣的是，NOTCH1突变型T-ALL患者的USP7表达水平明显高于NOTCH1野生型患者。此外，USP7在人类T-ALL细胞系和原发T-ALL患者中均高度表达。

研究结论：USP7在人类T-ALL中的表达水平更高。

5.下调USP7可降低ICN1蛋白水平并抑制体内外T-ALL细胞增殖     

        实验显示，下调USP7显著降低了JURKAT和MOLT-4细胞中的内源性ICN1蛋白水平。WB表明，USP7的耗尽与ICN1半衰期的减少有关。此外，USP7的敲低显著抑制了JURKAT和MOLT-4细胞的增殖。

        作者将JURKAT细胞静脉注射到NSG小鼠体内。结果发现。移植23天后对照组出现典型的白血病并开始死亡。而USP7缺乏组的脾脏比对照组的小得多，且其脾内淋巴白血病细胞浸润较少。此外，很多USP7缺失的小鼠中检测到的白血病细胞较少。

研究结论：USP7作为NOTCH1的上游调控因子，其在调节T-ALL的增殖中具有重要作用。

6.USP7的药理抑制诱导T-ALL细胞凋亡

        作者接下来评估了USP7抑制剂P22077对四个T-ALL细胞系细胞活力的影响。结果显示P22077以剂量依赖的方式降低细胞存活率。更重要的是，P22077对原代T-ALL细胞具有细胞毒性。利用Annexin V/PI双染试验，作者发现P22077显著诱导CCRF-CEM和CUTLL1的细胞凋亡。

研究结论：USP7抑制剂P22077对T-ALL细胞株和患者T-ALL细胞具有毒性作用。

结论与讨论

        本研究中,作者证实了USP7是一种新的NOTCH1去泛素酶,它能逆转NOTCH1多泛素化并维持NOTCH1蛋白稳定。在体内外，抑制USP7可导致NOTCH1降解并抑制T-ALL细胞增殖。作者的发现提供了一种终止NOTCH1信号的新途径，表明以USP7/NOTCH1信号轴为靶点是对抗T-ALL和其他NOTCH1相关恶性肿瘤的一种新策略。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41392-018-0028-3