百萤Annexin V，PacBlue缀合物作用以及实验方案

1. 百萤Annexin V，PacBlue缀合物简介以及作用

      Annexin V，PacBlue缀合物是美国AAT Bioquest研发的用于检测细胞功能的探针，膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白家族。 它们富含真核生物，属于参与信号转导的普遍存在的细胞质蛋白家族。 膜联蛋白V的优先结合配偶体是磷脂酰丝氨酸（PS），其通常保持在细胞膜的内叶（细胞质侧）。 在细胞凋亡中，PS被转移到质膜的外部小叶。 磷脂酰丝氨酸在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的通用指示，并且可以在观察到形态变化之前检测到。 我们的膜联蛋白V结合物是一组监测细胞功能的工具，旨在通过测量磷脂酰丝氨酸的易位来监测细胞凋亡。

       膜联蛋白V结合物在Ca2+存在下与凋亡细胞表面上的PS结合，它也可以通过坏死细胞膜或死细胞并与细胞内部的PS结合。 因此，我们建议将细胞不可渗透的核染色与膜联蛋白V结合物结合使用，以区分死细胞和凋亡细胞。

2. 百萤Annexin V，PacBlue缀合物参数

分 子 量      ～36000

溶      剂      Water

存储条件      在零下15度以下保存，避免光照

规       格     100 tests 

3. 百萤Annexin V，PacBlue缀合物实验方案

方案概述：

用测试化合物（200μL/样品）制备细胞

添加Annexin V结合物测定溶液

室温孵育30-60分钟

用流式细胞仪或荧光显微镜分析

具体实验步骤

(1)用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：

A.制备膜联蛋白V结合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

B.用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

C.离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。

D.将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中（来自步骤A）。

E.在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。

可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。

F.在室温下孵育30至60分钟，避光。

G.在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤A）以增加体积（参见下面的步骤H）。

H.使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤(2)或(3)）。

(2)使用流式细胞仪分析：

通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。

注意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van Engelend等人（见参考文献1和2）。

(3)使用荧光显微镜分析：

A.移取步骤(1)F的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤(1)A）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤(1)A）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。

注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白V缀合物孵育（步骤(1)F）后，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤(1)A）冲洗1-2次，并将膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤(1)A）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白V缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。

B.在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞

4.参考文献

White light-induced cell apoptosis by a conjugated polyelectrolyte through singlet oxygen generation
Authors: Jiamei Liang, Pan Wu, Chunyan Tan, Yuyang Jiang
Journal: RSC advances (2018): 9218--9222

Resources-Application Notes Phenotypic and Epigenetic Mechanism of Action Determinations of Histone Methylase and Demethylase Inhibitors using Digital Widefield Microscopy
Authors: Brad Larson, Peter Banks
Journal: Experimental Biology (2017)

Targeted Magnetic Intra-Lysosomal Hyperthermia produces lysosomal reactive oxygen species and causes Caspase-1 dependent cell death
Authors: Pascal Clerc, Pauline Jeanjean, Nicolas Halalli, Michel Gougeon, Bernard Pipy, Julian Carrey, Daniel Fourmy, Véronique Gigoux
Journal: Journal of Controlled Release (2017)

Detecting Apoptosis, Autophagy, and Necrosis
Authors: Jack Coleman, Rui Liu, Kathy Wang, Arun Kumar
Journal: (2016): 77--92