PCR仪使用注意事项-参数设定

PCR仪使用参数设定不正确会影响到PCR实验结果，这主要表现在温度、时间和循环次数上，如果温度参数设置过高，延伸时间不够都会对实验结果造成影响，下面谈谈使用PCR仪参数设定时的注意事项：
一、温度和时间
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间
变性温度低，解链不完整是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃ 1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间相结合。
③延伸温度与时间
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
二、循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量也随之增多。

如何确定pcr退火温度？以及程序设计？

具体没有定数，“退火温度要低于理论Tm值”只能说是常规操作、约定俗成，就算直接Tm值整数值跑也没问题，关键在于掌握Tm和退火温度、引物特异性之间关系：退火温度要低于理论Tm值，以使引物能够与可能的模板互补配对；同时，PCR仪退火温度设置还要可能足够高，以避免引物与模板间的非特异性扩增。综上，最佳的方法是采用“梯度（降落）PCR”，首先以引物Tm整数值为退火温度跑5~10个循环，然后以低于引物理论Tm值的温度【最低不低于引物理论Tm10℃，可采用Tm-5的温度跑】跑20~30个循环，以获得最佳PCR效果【既特异性强，又效率高、产物多】至于上下游引物Tm值应选取两者中的最低温度作为两条引物的Tm，并进而进行后续程序设置。一般引物Tm要在60，pcr退火参数温度在55，但也不必刻意强求。

PCR实验最常见的9个问题及解决方案

1. 如何有效设计引物

（1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。

2. PCR电泳无扩增条带

（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。

（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

3. PCR产物量过少

（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。

（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。

（4）引物量不足。增加体系中引物含量。

（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。

（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。

（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

4. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。

（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

（7）退火温度过低。

（8）电泳体系有问题：

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；

②凝胶没有凝固好；

③琼脂糖质量差。

（9）若为PCR试剂盒则可能：

①由于运输储存不当引起试剂盒失效；

②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

5. 扩增产物出现多条带（杂带）

（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

（5）样品处理不当。

（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。

（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。

6. 阴性对照出现条带

（1）试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

7. 条带大小与理论不符

（1）污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

（2）模板或引物使用错误。查看引物是否会扩增部分条带和模板是否正确。

3)基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

8. 持续出现假性条带

（1）起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的T值相差不大。可尝试适当提高PCR温度或者设置降落PCR，降低循环数。

9. 菌落PCR检测有条带，接种大摇后无条带

（1）可重新以菌落和菌液为模板进行PCR对照检测，因为菌落PCR的假阳性概率还是比较高。如果仍出现上述结果，推测可能是平板上连接液中的未连接载体的扩增引起的目的条带，进一步质粒PCR检测，可证明目的片段是否真正连接成功。