文献学习-肌球蛋白错误折叠与青光眼

引言

青光眼是导致不可逆性失明的主要原因(Tham et al。 ，2014) ，是一组慢性视神经病变，常伴有眼压(IOP)增加(Kwon et al。 ，2009)。

这个主要的危险因素，眼压升高，是由房水(AH)的产生和流出之间的不平衡引起的，房水(AH)是由睫状体产生的营养丰富的液体，滋养眼睛的前房(Goel 等，2010)。AH 通过眼内小梁网(TM)排出，这是维持眼内压的关键组织(Llobet et al。 ，2003)。TM 位于虹膜角膜角，即虹膜与角膜之间形成的角度(Goel et al。 ，2010)。

最常见的青光眼亚型，原发性开角型青光眼(POAG) ，是具有开放虹膜角的拥有属性性视网膜变性。成人发作 POAG (> 40岁)和青少年发作 OAG (3-40岁)青光眼影响全球6000万人(Allison 等，2020; Tham 等，2014)。

在这篇综述中，我们集中于 POAG 的子集，归因于肌球蛋白(MYOC)基因编码的突变。

肌纤维蛋白相关性青光眼估计占成人发病 POAG 的2-4% 和 JOAG 病例的10% ，并且拥有属性眼压升高(≥21mmHg)和严重的疾病进展(Aldred 等，2004; Fingert 等，1999)。自从2002年肌球蛋白的最后一篇综述发表在这本杂志(Tamm，2002)以来，已经收集到了许多新的见解。我们将自2010年以来在我们的实验室进行的生物化学和细胞研究作为评论的中心(图1) ，使用分子生物物理学和结构生物学常用的技术(表1)检查肌球蛋白结构的分子细节和其致病性错误折叠的淀粉样蛋白性质。还将探索开放的问题，如肌球蛋白仍然难以捉摸的生物学功能，我们的工作所启动的新的翻译方向，良性多态性和致病突变之间的分化以及野生型(WT)肌球蛋白和青光眼之间的潜在联系。

肌纤维蛋白相关性青光眼的遗传学及临床特征

普通人群中青光眼的患病率 < 1% ，但 POAG 患者的一级亲属发生青光眼的几率为4-16% (礼顿，1976) ，表明存在潜在的遗传易感性。

MYOC 是第一个被发现的青光眼基因座，并且一直是与青光眼最强的遗传联系。观察到肌纤维蛋白相关性青光眼的常染色体显性遗传模式，以及早于40岁的诊断，IOP 大于25mmHg，平均杯盘比 > 0.3(Gordon 等，2002)。历史上，肌纤维蛋白相关的 POAG 已经在诊断年龄为4岁的大家系中被观察到(Rozsa 等，1998) ，IOP 高达77mmHg。

自肌球蛋白突变的最初发现以来，人群和家族病例对照遗传学研究已经在肌球蛋白中鉴定了许多错义，同义，停止增益和移码突变(Fingert 等，1999,2002; Hewitt 等，2008; Liu 和 Allingham，2017; Tamm，2002)。在 Myocilin.com 网站上(Hewitt et al。 ，2008)在线整理了具有相关临床指标的肌球蛋白变体(> 300)。绝大多数已知的引起青光眼的突变是错义编码突变(Fingert 等，1999,2002; Hewitt 等，2008; Resch 和 Fautsch，2009)。

一般来说，致病突变可能发生在人群中的低等位基因频率(Karczewski et al。 ，2020)。因此，MYOC 的突变一般不会在青光眼全基因组关联研究中发现(Craig et al。 ，2020)。换句话说，肌球蛋白突变在一般人群中发现得越普遍，它的致病性就越低。在 gnomAD (Karczewski et al。 ，2020) ，( https://gnomAD.broadinstitute.org/gene/ensg00000034971?dataset=gnomad_r2_1)中列出的基于基因组测序数据的 something 100个基于群体的突变中，最常见的 OLF 定位的非同义编码变体(K398R 和 E352K)不被认为是致病性的。Q368X 在结构 OLF 结构域中途停止翻译，可能是一种遗传修饰因子(Craig et al。 ，2020)。有趣的是，一些青光眼相关突变聚集在特定种族内，例如 G246R/意大利和 Y479H/西班牙，而另一些突变已经在不同国籍的多个家族中被鉴定，例如 P370L (表2)。相反，在特定人群中也发现一些与疾病没有直接关系的肌球蛋白突变，例如主要在非洲人或非洲裔美国人后裔中发现的 E352K (Scelsi 等，2021)。值得注意的是，非洲人后裔的青光眼风险比其他民族高2.8倍(Restrepo 和 Cooke Bailey，2017) ，但迄今为止没有数据暗示肌球蛋白变体 E352K 在疾病中(Scelsi 等，2023)。

肌球蛋白的表达与检测

肌球蛋白在小梁网中的表达

根据其分泌信号序列(见第4.1节) ，肌球蛋白从细胞分泌到细胞外液。

Myocilin 在整个身体中表达，在 TM（小梁网） 中表达水平特别高(adamet al。 ，1997)。

如 Polansky 等(1997)所示，在基线组成型表达之上，TM 中的肌球蛋白表达可由皮质类固醇如 DEX 诱导。因此，响应于 DEX 处理的肌球蛋白表达增加通常用于区分 TM 细胞与前段中的其他细胞类型(Keller 等，2018; Nguyen 等，1998; Polansky 等，2000)。有趣的是，尽管肌球蛋白表达的逐渐诱导与皮质类固醇诱导的青光眼(天-周)的临床表现同时发生(Polansky 等，1997) ，并且肌球蛋白诱导的剂量反应也模拟了接受糖皮质激素治疗的患者的眼压增加和流出阻力(Armaly，1963a，1963b) ，但由于发现 DEX 治疗仍然可以诱导 Myoc-/-小鼠的眼压升高，已经排除了肌球蛋白和类固醇诱导的眼压升高之间的直接关系(Patel 等，2017)。

翻译后修饰

一些肌球蛋白的翻译后修饰已被报道，尽管它们与蛋白质合成、折叠和功能的联系尚不清楚。首先，实验证实了分泌信号(Nguyen 等，1998; Shepard 等，2003)。其次，由于 N57处不完全的 N- 糖基化，人类肌球蛋白在变性和还原凝胶电泳上表现为55/57-kDa 双重(Jacobson 等，2001; Nguyen 等，1998; Shepard 等，2001)(Shepard 等，2003)。第三，已经提出了一些关于肌球蛋白的细胞内内蛋白水解加工的证据(Aroca-Aguilar 等，2005) ，特别是通过粘附的 HEK293T 细胞中的 calpain II (Sanchez-Sanchez 等，2007)。

据我们所知，从 TM 细胞中分离的肌纤维蛋白没有发现蛋白水解切割，这表明蛋白质组和相关调控可能是不同的，但是与功能或发病机制的任何相关性仍然是未知的。

肌球蛋白的结构

olfactomedin (OLF)的致病性突变

超过90% 的已知引起青光眼的突变是位于 OLF 结构域的错义编码突变(Fingert 等，1999,2002; Hewitt 等，2008; Resch 和 Fautsch，2009)

结构研究表明，致病的 OLF 变异体(表2)分布在 OLF 结构域的所有5个叶片(图2F)(Donegan 等，2015)。在 OLF 结构可用之前，还不清楚疾病变异体是否会聚集在三级结构中，因为在折叠蛋白中，远在序列上的残基可以在空间上靠近。我们试图强调出现致病性突变的结构部分，例如连接刀片 B 到 C 的长环，金属中心和疏水带(Donegan 等，2015)。但是，这并不是严格的集群。OLF 螺旋桨的径向特性限制了任何给定氨基酸与序列中 something 30个残基(即包含螺旋桨叶片的典型残基数)内的其他氨基酸之间的相互作用。

致病机制: 肌纤维蛋白错误折叠导致功能损伤

突变的肌球蛋白细胞内聚集体具有淀粉样蛋白的特征

细胞有复杂的过程，不正确折叠的蛋白质被分流和降解(Houck et al。 ，2012)。因此，观察到致病性突变型肌球蛋白作为不溶性物质在清洁剂 Triton X-100(Zhou 和 Vollrath，1999)中积累，向我们表明聚集体可能不是无定形的，而是称为淀粉样蛋白的模板纤维状物质。

一般来说，通过折叠的蛋白质形成淀粉样蛋白涉及部分解折叠到聚集倾向状态，首先聚集在一起形成寡聚体，其聚集在一起形成原纤维，并进一步形成模板成熟纤维形成(图4A)。

淀粉样蛋白在 Triton x-100这样的苛刻试剂中难以重新增溶，并且常见于蛋白质错误折叠疾病，如阿尔茨海默病，帕金森病和肌萎缩性嵴髓侧索硬化症等。

分子伴侣介导的降解不能去除突变型肌球蛋白

泛素-蛋白酶体途径不能清除 ER 内错误折叠蛋白质的突变型肌球蛋白聚集，可能引发 ER 应激并导致细胞死亡(Liu and Vollrath，2004)。

我们的实验室与 Brian Blagg 和已故的 Chad Dickey 合作，确定突变型肌球蛋白是葡萄糖调节蛋白94(Grp94)的客户(Suntharalingam 等，2012)。Grp94通过 ER 相关降解(ERAD)过程对突变型肌球蛋白进行分流，突变型肌球蛋白被适当地泛素化，但 ERAD 最终失败。当 Grp94被 siRNA 耗尽时，突变的肌球蛋白被降解。另外的研究发现 OLF 和 Grp94之间的相互作用定位于 N- 末端核苷酸结合结构域。Grp94(Grp94N) N- 末端结构域的存在增加了体外检测的 OLF 聚集率。

疾病有关的 OLF 在热力上不稳定，并采用非天然结构

一般来说，由折叠蛋白(例如肌球蛋白 OLF 结构域)形成的淀粉样纤维形成是由突变或其他环境扰动引起的初始部分展开事件促进的(图4A)。

这种情况暴露了易于发生淀粉样蛋白聚集的多肽链的片段，称为易于发生淀粉样蛋白聚集的区域(APR) ，用于进一步模板化聚集体。使用基于荧光的稳定性测定(表1) ，我们的实验室建立了 OLF 内引起青光眼的突变经历了热稳定性的损害，首次表明疾病变体正在采用非天然的，部分折叠的蛋白质状态。在我们最初的研究中，我们注意到最不稳定的变异与早发性青光眼相关(Burns et al。 ，2011) ，但是我们后来重新审视了这个观点(见7.1.1节)。与 OLF 相反，CC/LZ 内的变异不影响稳定性，也不容易聚集(Hill 等，2017)。

开放性问题和未来方向

从基因型预测表型

基因组和外显子组测序数据的爆炸式增长已经产生了新的肌球蛋白突变，所有这些突变都是相对罕见的(“1% 的人口”)。

绝大多数的这些突变是新的，没有临床数据可用，把他们放在不确定的致病性的类别。OLF 内特定突变的致病性得到了临床和实验室数据的最佳支持。相反，由于缺乏临床数据或实验室角色塑造，致病性的确定性较低。为预测突变对合成蛋白质功能的影响而开发的计算算法是针对功能丧失突变而量身定制的。这些算法在功能突变获得的情况下表现不佳(Flanagan 等，2010) ，例如肌球蛋白相关青光眼的情况(Scelsi 等，2021)。

将任何给定的肌球蛋白突变分配为致病性的能力将是变革性的，因为它将激发基因分型用于青光眼的早期诊断和监测或干预，青光眼是一种无痛性疾病，经常被诊断直到良好的进展和视野丧失(Kendrick，1999)。

实验上，我们观察到突变的矛盾后果，特别是当金属中心受到干扰时: D380A 错误折叠和致病性，而 D478S/A/N 变体更稳定，并且不聚集，尽管采用非天然折叠。

此外，从基因型预测表型的能力将推动开发新的精确药物治疗肌纤维蛋白相关性青光眼。

OLF结构域

在最近的文献检索中，我们回顾了97个 OLF 驻留的肌纤维蛋白变异体致病性的证据。我们考虑的致病性标准是多代测序数据显示常染色体显性遗传模式，早发性 POAG 的临床诊断，以及表明错误折叠表型的支持数据(见第6节)。

其中，23个错义突变和1个 indel 变体符合所有的致病性标准，7个符合良性标准。其余的错义变体共57个，具有不确定的致病性，其中23个被认为可能致病，但在一个或多个标准中缺乏数据(表2)(Scelsi 等，2021)。

由临床基因组资源(ClinGen)变异治疗专家小组(VCEP)独立进行的青光眼分析考虑了15个致病性因素，包括被认为更可能致病的罕见突变的等位基因频率; 对基因产物具有不利影响的突变的计算证据; 体外或体内破坏作用的证据; 以及对照人群中的存在(良性)与家族内多代共分离(致病性)(Burdon 等，2022)。ClinGen 对非同义 OLF 变异的分类与我们的分析一致。唯一的例外是 Q368X; ClinGen 的评估将这种变异标记为致病性的，而我们的评估具有不确定的意义。

展望未来，ClinGen 定义的标准化规则集为全球实验室分类新的 OLF 变体提供了一致的框架(Burdon 等，2022)。

WT 肌球蛋白在特发性青光眼中的可能作用

基于其他蛋白质错误折叠疾病如肌萎缩性嵴髓侧索硬化症(Mathis et al。 ，2019) ，阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)和克雅二氏病(Goldman et al。 ，2004)的相似性，我们预计更好地理解由遗传性突变引起的青光眼将为散发性青光眼提供更一般的致病机制。

蛋白质抑制随着年龄的增长而下降(Hipp 等，2019) ，内质网应激在青光眼 TM 细胞和组织中已有记录(Peters 等，2015)。内质网应激会触发未折叠蛋白反应，激活下游反应，试图改善蛋白质折叠和质量控制途径。慢性内质网应激最终超越 UPR 并导致细胞凋亡(Hetz 和 Saxena，2017)。结合知识，WT OLF 可能与轻度环境压力错误折叠，似乎合理的是，WT 肌球蛋白可以在已知的条件下造成青光眼。

结论

总之，过去20年的研究已经使我们对肌细胞丝蛋白有了更好的基础理解，特别是从结构、生物物理和细胞的角度。

自2010年以来，我们实验室的工作贡献了 OLF 结构域，CC/LZ 区域的高分辨率结构，以及作为独特的 Y 形四聚体的全长肌球蛋白模型。我们还已经确定，导致青光眼的 OLF 突变以引发其形成具有淀粉样蛋白特征的聚集体的方式使肌球蛋白不稳定，并且阻断与 Grp94的异常相互作用导致突变的肌球蛋白降解。

通过利用我们的结构见解，我们已经产生了新的肌球蛋白抗体，这些抗体有望在不同的研究背景下改善肌球蛋白的检测，并且通过将临床数据与我们的生物物理学研究相结合，我们已经建立了可用于区分致病性和良性变体的定量热稳定性截断值。我们的研究显示了基础分子科学研究的各种方法，即使是它的简化方法，也可以有助于解决复杂的生物医学问题。

我们乐观地认为，我们的见解将有助于指导我们和其他人今后的努力，以了解青光眼的潜在发病机制，并揭示青光眼治疗的新方向。