免疫组化((immunohistochemistry,IHC)+免疫荧光(Immunofluorescence,IF)
这篇是写石蜡切片的免疫组化和免疫荧光~~~
之前做了冰冻切片，最近在做石蜡切片，我的石蜡切片都是让公司十块钱一个进行包埋，然后自己切的，也可以直接让公司给你切，至于石蜡和冰冻的区别如下
切片：1.切片前一晚把蜡块冻在-30过夜，这样第二天切的话就比较好切
2.切片就是操作机器了，是技术活，我的左手非常不灵敏，所以操作就是真的慢啊
3.切完之后要放在60°烘箱，烤1小时，然后就可以常温储存啦
开始啦~~
2-13步，全程注意不要干片！
将石蜡切片放入烘箱，70°烤片2-3h；
2.室温脱蜡、水化：通风橱内，将切片置于 a槽：二甲苯10min；b槽：二甲苯10min；c槽：无水乙醇，5min；d槽：无水乙醇，5min；e槽：95%酒精，5min；f槽：85%酒精，5min；g槽：75%酒精，5min；h槽：50%酒精，5min；
此步骤是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
3.热抗原修复：将经过脱蜡的切片先置于水中，预热抗原修复液（柠檬酸钠粉末配置的，一包配两升）我用的是蒸蛋器，实验室的师兄师姐，高压锅，微波炉，水浴锅，用啥的都有，emmm就就地取材吧，预热一会，然后把切片放入预热好的抗原修复液中，然后蒸煮30min，也可以根据具体情况，适当延长抗原修复时间，然后自然冷却室温；
为了得到更好的实验结果，在获得样本后，会对其进行固定，一般常用的就是福尔马林或者多聚甲醛溶液。科学研究已经证明甲醛的醛基与蛋白质发生交联反应，不同程度的遮蔽了抗原表面的抗原决定簇，影响其与抗体结合。其发生交联反应形成的究竟是什么还没有定论，有人说形成的是醛基，有人说形成的是羧甲基。但不管是什么，都会使抗原表面的决定簇减少，影响实验结果，甚至产生假阳性。
4.置于水中，摇床洗5min，免疫组化笔画圈，注意：一定避免干片，画完先放入水中，然后把片子，摆入湿盒，一起加内源性过氧化物酶阻断剂（要完全覆盖组织，目的是去除内源性过氧化物酶），15min；
5.PBS洗三次，每次5min；
6.封闭：5%BSA封闭1h（注意，这里的BSA是用PBST配置的，0.1％PBST：PBS加0.1％的吐温）；
7.孵一抗：相应的抗体按照protocol的比例用步骤6中的BSA稀释，甩掉封闭液，加上一抗，4°过夜；
8.将过夜孵育一抗的片子拿出来台面放置10min，恢复室温；
9.回收一抗，PBS洗三次，每次8min；
10.滴加二抗，37°半小时；
11.PBS洗三次，每次8min；
12.显色:加入DAB显色剂(现配现用，即底物液加20份浓缩DAB溶液1份)室温孵育1-10min，在显微镜下观察阳性对照显色情况，待出现理想阳性显色且无明显背景时终止显色；
＋苏木素染核，加上几秒，流水洗掉就可（不要对着直冲）；
原理是在HRP的催化下，H₂O₂将DAB氧化成还原型的DAB,还原型的DAB呈棕色的不溶性沉淀
13.用水洗2次，各3min；
14.脱水透明:75%酒精3min，85%酒精3min，95%酒精3min，无水乙醇3min，二甲苯透明5min，换用新鲜的二甲苯再透明3min；
15.晾干后，用中性树胶封片。
然后就可以镜下观察了~~~~~
