最早的基因编辑工具——归巢核酸内切酶(Meganuclease)

2020-05-22 22:01 作者:制御秘书长杜鹃 0人读过 | 我要投稿

今天介绍的是最早的基因编辑工具——归巢核酸内切酶(Meganuclease)

简介

归巢核酸内切酶(Meganuclease)是具有较大识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)特征的脱氧核糖核酸内切酶，该酶的切割位点在任何给定的基因组中通常只出现一次。例如，被I-SceI归巢核酸内切酶识别的18个碱基对的序列平均需要一个人类基因组大小的二十倍的基因组才能被一次偶然发现(尽管具有单个错配的序列对于每个人来说大约发生三次每一个人类的基因组)。因此，归巢核酸内切酶被认为是最特异性的天然限制酶。

在归巢核酸内切酶中，归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族已成为过去15年研究基因组和基因组工程的重要工具。归巢核酸内切酶是“分子DNA剪刀”，可用于以高度靶向的方式替换，消除或修饰序列。通过蛋白质工程修饰它们的识别序列，可以改变目标序列。归巢核酸内切酶用于修饰所有基因组类型，无论是细菌，植物还是动物。它们为创新开辟了广阔的渠道，特别是在人类健康领域，例如，消除HIV病毒遗传物质或使用基因疗法“修复”受损的基因。

两大“帮派”

归巢核酸内切酶存在于许多生物中：古细菌、细菌、噬菌体、真菌、酵母、藻类和一些植物。它们可以在细胞的不同区域中表达–细胞核、线粒体或叶绿体。已经鉴定出数百种这些酶。

归巢核酸内切酶主要由两个主要的酶家族(统称为归巢核酸内切酶)代表：内含子内切核酸酶和内含肽内切核酸酶。

在自然界中，这些蛋白质由移动遗传元件，内含子或内含肽编码。内含子通过在DNA的精确位置进行干预而传播，其中大范围核酸酶的表达在互补的无内含子或无内含肽的等位基因中产生断裂。对于内含子和第I组内含子，这种断裂通过双链DNA断裂的同源重组修复导致内含子或内含子在切割位点重复。

我们对归巢核酸内切酶的实际用途知之甚少。人们普遍认为，编码归巢核酸内切酶的遗传物质起着寄生元件的作用，利用其自身的优势，利用双链DNA细胞修复机制作为繁殖和扩散的手段，而不会破坏其宿主的遗传物质。

来自LAGLIDADG家族的归巢核酸内切酶

归巢核酸内切酶有五个家族或五类。最广泛和最广为人知的是LAGLIDADG系列。LAGLIDADG家族核酸内切酶主要存在于真核单细胞生物的线粒体和叶绿体中。

该家族的名称对应于在该家族的所有蛋白质中或多或少保守的氨基酸序列，这些小蛋白质还以其紧凑和紧密堆积的三维结构而闻名。

在研究和基因组工程中最广泛使用的特征最丰富的核酸内切酶包括I-SceI(发现于啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae的线粒体中)，I-CreI(来自衣藻Chlamydomonas reinhardtii的叶绿体)和I-DmoI(来自古菌Desulfurococcus mobilis)。

最著名的LAGLIDADG核酸内切酶是同型二聚体（例如I-CreI，由两个相同蛋白质结构域的副本组成）或内部对称单体(I-SceI)。包含催化结构域的DNA结合位点由切割点两侧的两个部分组成。半结合位点可以非常相似并与回文或半回文DNA序列(I-CreI)结合，或者它们可以是非回文(I-SceI)。

内含子编码的核酸内切酶I-SceI

内含子编码的核酸内切酶I-SceI是归巢核酸内切酶。该酶在生物技术中用作归巢核酸内切酶。它识别一个18个碱基对的序列TAGGGATAACAGGGTAAT，并留下一个4个碱基对的3'羟基突出端。对核酸内切酶来说，这是一种罕见的切割。经统计学研究，每6.9x10^10个碱基对将出现一次18bp的序列(出现概率为1/4^18)。该序列通常不会在人类或小鼠基因组中出现。I-SceI由内含子编码，它存在于酿酒酵母的线粒体中。

基因编辑的工具

归巢核酸内切酶的高特异性使其比其他天然限制酶具有更高的精确度和更低的细胞毒性。大范围核酸酶在1990年代被鉴定出来，随后的工作表明它们是基因组工程和基因编辑的特别有前途的工具，因为它们能够有效地诱导同源重组，产生突变，和改变阅读框架。

但是，可以进行的归巢核酸内切酶诱导的基因重组受到可用归巢核酸内切酶组成的限制。尽管自然界中存在数百种归巢核酸内切酶，而且每个都可以忍受其识别位点的微小变化，但发现能够在所需位置切割给定基因的归巢核酸内切酶的可能性非常小。几个小组将注意力转移到了工程化针对目标识别位点的新的归巢核酸内切酶上。

最先进的研究和应用涉及LAGLIDADG家族的归巢核酸内切酶。

为了创建量身定制的大范围核酸酶，已采用了两种主要方法：

1.通过在氨基酸序列中引入少量变异，然后在自然识别位点的变异中选择功能性蛋白质，来修饰现有大范围核酸酶的特异性。

2.更根本的选择是开发一种在归巢核酸内切酶天然高度多样化中发挥重要作用的特性：将不同酶的蛋白质结构域关联或融合的可能性。此选项使开发具有新识别位点的嵌合归巢核酸内切酶成为可能，该新识别位点由归巢核酸内切酶A的半位点和蛋白质B的半位点组成。通过融合I-DmoI和I-CreI的蛋白质结构域，两个嵌合归巢核酸内切酶具有使用以下方法创建的：E-Drel和DmoCre。

可以结合使用这两种方法来增加创建新酶的可能性，同时保持高度的功效和特异性。自1999年以来，Cellectis的科学家一直在进行基因编辑，并从同型二聚体归巢核酸内切酶I-CreI以及其他归巢核酸内切酶支架中开发了超过20,000个蛋白质域。可以将它们组合形成功能性的嵌合量身定制的异二聚体，用于研究实验室和工业用途。

另一家生物技术公司Precision Biosciences已经开发出一种完全合理的设计过程，称为定向核酸酶编辑器(DNE)，它能够创建靶向并修饰基因组中用户定义位置的工程化归巢核酸内切酶。2012年，拜耳作物科学公司(Bayer CropScience)的研究人员使用DNE将基因序列整合到棉花的DNA中，将其精确地靶向预定位点。

其他应用

使用归巢核酸内切酶进行基因组工程的最新进展是将转录激活因子样(TAL)效应子的DNA结合结构域并入杂交核酸酶。这些“megaTAL”将TAL效应子的易加工性和高DNA结合特异性与大范围核酸酶的高切割效率相结合。此外，大范围核酸酶已与DNA末端加工酶融合，以促进容易出错的非同源末端连接，并增加给定基因座上诱变事件的频率。

可能性

如开篇所述，具有18个碱基对序列的归巢核酸内切酶平均需要一次偶然发现一次人类基因组大小二十倍的基因组。计算公式为4^18/3x10^9 = 22.9。但是，非常相似的序列更为常见，随着频率的提高，允许的错配越多。

例如，除一个碱基对外，所有序列都相同的序列平均每4^17/18x3x10^9 = 0.32个人类基因组当量就会出现一次，或者每个人类基因组出现3次。平均而言，除了两个碱基对之外，所有其他序列均相同的序列每4^16/(18C2)x3x10^9 = 0.0094个人类基因组当量平均发生一次，或每个人类基因组107次。

这很重要，因为酶没有完美的区分能力。即使序列不完全匹配，核酸酶仍会起作用。因此，核酸酶在一个错配序列上的活性小于无错配情况，而对于两个错配，其活性甚至更低，但仍不为零。这些非常相似但不完全相同的序列的排除仍然是基因组工程中需要克服的重要问题。