实验诊断学第二章骨髓细胞检测学

第二章骨髓细胞学检测   

涉及骨髓细胞形态学检查（最常用）、骨髓细胞化学检查、骨髓病理学检查、细胞遗传学检查、细胞免疫学表型分析、造血细胞培养。

掌握：

〇、骨髓细胞学检查的适应症与禁忌症

适应症：

①外周血细胞成分及形态异常。

②不明原因的发热，肝、脾、淋巴结肿大。

③骨痛、骨质破坏、肾功能异常、黄疸、紫癜、血沉明显增加、血浆蛋白异常、免疫球蛋白异常。

④化疗后的疗效观察。

⑤需要骨髓做标本的检查，如骨髓活检、造血祖细胞培养、染色体核型分析、微生物及寄生虫检查。

禁忌症：血友病

晚期妊娠者应慎重。

一、骨髓细胞学检测的方法及内容

1、肉眼观察

2、低倍镜下观察

1）先评价涂片质量，在选择理想涂片观察。

①取材评价：良好的骨髓涂片可见骨髓小粒，镜下可见骨髓特有的细胞。

②涂片评价：涂片适当的骨髓片，镜下可见有细胞分散排列、不重叠的区域。

③染色评价：染色满意的骨髓涂片，镜下见细胞核、质颜色分明，颗粒清楚，整个涂片没有沉渣。

2）估计骨髓有核细胞增生程度。

介于两者之间，增生程度往上提（稀释）。

3）计数巨核细胞数目

4）特殊细胞与其他

如转移到骨髓的癌细胞、大体积的淋巴瘤细胞、戈谢细胞、Niemann-Pick细胞。

5）血液寄生虫

不明发热病人，注意观察成熟红细胞内的疟原虫病原体、巨噬细胞内的黑热病原虫。

3、油浸镜检查

4、骨髓象的分析与报告

包括骨髓有核细胞增生程度；

粒细胞与有核红细胞比例；

粒系统、红系统（包括成熟红细胞）、巨核系统、淋巴系统、单核系统和其他血细胞改变。巨核细胞单独计数并描述血小板分布状态

 

二、血细胞发育过程中形态演变的一般规律

1、细胞体积

胞体逐渐由大变小。但巨核细胞由小变大，早幼粒细胞较原始粒细胞稍大。

大小变化常伴有形态改变，巨核细胞、单核细胞由圆形变为不规则形。

2、细胞质

①量：由少逐渐增多，但淋巴细胞变化不大。

②染色：由深蓝变浅染，甚至淡红，红细胞系最终呈橙红色。

③颗粒：由无颗粒（原始细胞）→嗜天青颗粒（早幼粒细胞）→特异性颗粒（中性、嗜酸性、嗜碱性颗粒）；单核细胞类似。但幼红细胞无颗粒，淋巴细胞仅NK细胞有颗粒。

3、细胞核

①大小：由大变小，由规则变不规则，甚至分叶。但巨核细胞核由小变大；红细胞系核变小，核形规则，成熟后脱核。

②染色质：由细致疏松逐渐变为粗糙、致密或凝集成块，着色由浅变深。

③核仁：由有到无。

④核膜：由不明显到明显。

4、核/质比例

由大变小，即由核大质少到核小质多。巨核细胞相反。

 

三、血细胞的正常形态学特征   熟悉

l  粒细胞系统

1）原始粒细胞：胞核较大，占细胞的2/3以上。核染色质呈淡紫红色平坦的细沙粒状。核仁2~5个，清楚易见。胞质量少，呈天蓝色，绕于核周。正常胞质内无颗粒，称Ⅰ型原始粒急性髓系白血病的原始粒细胞可有少量细小紫红色颗粒，称Ⅱ型原始粒细胞。

2）早幼粒细胞：胞体较原始粒细胞大。胞核大。染色质开始聚集呈粗粒状，核仁可见或不清晰。胞质量增多，呈略深蓝色，核周的一侧可出现淡染区域。胞质内含有大小、形态和数目不一、分布不均的紫红色非特异性嗜天青颗粒。

3）中幼粒细胞

①中性：胞核椭圆或一侧开始变扁平。染色质聚集成粗索状或小块状，紫红色，核仁消失。胞质量相对增多，淡橙红色，内含细小、分布均匀、淡紫红色的特异性中性颗粒。

Ø  部分细胞残余粗大早幼粒细胞颗粒。

②嗜酸性：胞体大于中性中幼粒细胞，胞核与中性中幼粒细胞相似。胞质内充满粗大、均匀、排列紧密橘黄色特异性嗜酸性颗粒。

③嗜碱性：胞体小于中性中幼粒细胞，胞核与上述细胞相似，但轮廓不清，染色质结构模糊。胞质内含数量不多、大小不一、较粗大、分布散乱的紫黑色特异性嗜碱性颗粒，比较特别的是其颗粒可覆盖在细胞核上。

4）晚幼粒细胞：胞核明显凹陷呈肾形。核染色质粗糙呈粗块状，排列紧密，深紫红色。胞质量多。胞质内含中性、嗜酸性和嗜碱性特异性颗粒，分别为中性、嗜酸性和嗜碱性晚幼粒细胞。中性者胞质呈淡橙红色，另两种着色不清或淡紫色。

5）杆状核粒细胞：细胞呈圆形，直径10-15μm。胞核狭长，弯曲呈带状、条状、枝杆状，两端钝圆。核染色质粗糙呈块状，深紫红色。胞质中含特异性颗粒，分别为中性、嗜酸性、嗜碱性杆状核粒细胞三种。

6）分叶核粒细胞

①中性：胞核分叶状，常分为2-5叶（分3叶者多见），叶与叶之间有一细丝相连或完全断开(若为两丝相连界定为杆状核)。染色质浓集或呈小块状，深紫红色。胞质呈淡橙红色，布满细小紫红色的中性颗粒。

②嗜酸性：胞核多分为近似对称的两叶，深紫红色。胞质中充满密集粗大、大小均匀的橘红色嗜酸性颗粒，胞质着色不清或淡紫色。

③嗜碱性：胞核的分叶由于嗜碱性颗粒的遮盖，轮廓和结构模糊，深紫红色。胞质中有稀疏的大小不一、分布不均、呈紫黑色的嗜碱性颗粒，胞质着色不清或淡紫色。

l  红细胞系统

1）原始红细胞：细胞边缘有时可见伪足或突起。胞核正圆形，约占细胞的4/5。核染色质呈粗糙粒状，较原始粒细胞着色深且粗密，紫红色。暗紫色核仁1～5个。胞质量较少，呈不透明的浓厚深蓝色，核周可有淡染区，胞质内无颗粒。

2）早幼红细胞：胞核正圆形，占细胞的2/3以上。染色质开始凝集成小块状，紫红色，核仁模糊或消失。胞质量稍多，呈不透明深蓝色，仍可见伪足或突起及核周淡染区，无颗粒。

3）中幼红细胞：胞核正圆形，约占细胞的1/2。染色质凝集成团块状或粗索状，深染紫红色，似车轮状排列或边缘有裂缝感，其间有明显的淡染区域。逐渐有血红蛋白合成，胞质蓝色变淡，部分可呈蓝中带红的蓝灰色。

4）晚幼红细胞：胞核正圆居中，占细胞的1/2以下。核染色质凝聚成大块状或固缩成团，呈紫褐色或紫黑色。胞质量多，呈均匀淡的灰蓝色、灰紫色、灰红色。

l  淋巴细胞系统

1）原始淋巴细胞：胞核大，圆形或椭圆形，稍偏位。核染色质细致，呈颗粒状，但较原始粒细胞稍粗，着色较深，染色质在核仁周围有浓集现象，核膜浓厚而清晰。核仁多为1~2个，小而清楚，呈淡蓝色或无色。胞质量少，呈透明、透亮的天蓝色，不含颗粒。

2）幼稚淋巴细胞

3）淋巴细胞

①大淋巴细胞：胞核偏于一侧或着边。染色质常致密呈块状，排列均匀，呈深紫红色。胞质丰富，呈透明天蓝色。个别细胞可有少量大而稀疏的嗜天青颗粒，为淋巴细胞中的NK细胞。

②小淋巴细胞：染色质粗糙致密呈大块状，紫红色。胞质量极少，有时几乎不见而似裸核。

l  浆细胞系统

1）原始浆细胞：胞核圆形，占细胞的2/3以上，核可偏位。核染色质呈粗颗粒网状，紫红色。核仁2～5个。胞质量多，呈深蓝色，不透明，核的一侧可有半圆形淡染区，不含颗粒。

2）幼稚浆细胞：胞核圆形，占细胞的1/2，核偏位明显。核染色质开始聚集，深紫红色，核仁模糊或消失。胞质量多，呈不透明蓝色，近核处淡染区较大。

3）浆细胞：核偏位明显。核染色质凝聚成块，呈条索状，深紫红色。胞质丰富，呈不透明深蓝色或蓝紫色，核的一侧有较大面积淡染区，可见小空泡。

l  单核细胞系统

1)原始单核细胞：胞核较大，圆形或椭圆形。核染色质纤细疏松网状，淡染紫红色。核仁1-3个，大而清楚。胞质丰富，呈浅灰蓝色，半透明毛玻璃样，边缘常不整齐，有时可有伪足状突起，不含颗粒。

2)幼稚单核细胞：胞核圆形或不规则形，可有凹陷，切迹，扭曲或折叠。染色质仍呈疏松丝网状，但稍粗，染淡紫红色。核仁模糊或消失。胞质量多，呈灰蓝色，边缘可有伪足突出，淡紫红色嗜天青颗粒。

3)单核细胞：圆形或不规则形，边缘常见伪足突出。胞核不规则、呈肾形、马蹄形、笔架形、“S”形，并有明显扭曲折叠。染色质疏松，有压缩感，呈淡紫红色丝网状。胞质丰富，呈淡灰蓝色或淡粉红色，淡紫红色颗粒。

4)巨噬细胞：单核细胞出血管壁进入组织后转变成巨噬细胞。胞体大小不一。细胞呈圆形、椭圆形或不规则形。胞核呈圆形、椭圆形、肾形或不规则形，偏位。核染色质粗或疏松、淡染，呈紫红色网状结构，可见核仁或无核仁。胞质丰富，呈不透明灰蓝色或蓝色，不含颗粒或少量嗜天青颗粒，常见空泡和已被分解或消化的吞噬物。

l  巨核细胞系统

1）原始巨核细胞：胞质不透明深蓝色。

2）幼稚巨核细胞：胞体明显增大。胞核开始有分叶，近核处可出现淡蓝色淡染区，嗜天青颗粒。

3）颗粒型巨核细胞：胞体明显增大。胞核明显增大，分叶不规则常层叠呈堆集状。胞质极丰富，呈淡紫红色，其内充满大量细小紫红色颗粒，有时可见边缘处颗粒聚成簇，为血小板前体，但无血小板形成和脱落。

4）产血小板型/成熟型巨核细胞：胞质内颗粒显聚集成簇，周缘部分裂解为血小板而脱落，使细胞边缘不完整。其余均与颗粒型核细胞相同。

5）巨核细胞裸核：即产血小板型巨核细胞的胞质裂解成血小板完全脱落后，余下的细胞核。

 

四、血细胞的常见细胞化学染色

1、髓过氧化物酶（MPO）染色——胞质蓝黑色颗粒

结果：

胞质无蓝黑色颗粒者为阴性；

出现细小颗粒、分布稀疏者为弱阳性；

颗粒大而密集者为阳性或强阳性。

临床意义：

主要用于急性白血病类型的鉴别→急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病。

急性髓系白血病（AML）的急性粒细胞白血病——阳性、强阳性。

急性单核细胞白血病——弱阳性或阴性。

急性粒、单细胞白血病——阳性、弱阳性、阴性并存

急性淋巴细胞白血病（ALL）——阴性

2、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色——胞质

结果：

NAP主要存在于成熟的中性粒细胞（分叶核及杆状核）和巨噬细胞中，其他血细胞均呈阴性反应。

阳性反应为胞质中出现浅到深的颜色沉淀物，反应强度分为5级，即-、+、++、+++、++++。

反应结果以阳性反应细胞百分率和积分值来表示。

血涂片染色后，油浸镜观察100个成熟中性粒细胞，阳性反应细胞所占百分率即为阳性率；对所有阳性反应细胞按反应强度分级。将各级所占的百分率乘以级数，然后相加即为积分值。

参考值：

成人NAP阳性率10%~40%；积分值40~80分。

Ø  应建立本实验室的参考值。

临床意义：

1）感染性疾病：细菌性感染时NAP活性明显增高，病毒性感染时其活性在正常范围或略减低。

2）鉴别诊断的参考

①慢性髓系白血病的NAP活性明显减低，积分值常为0。

细菌感染引起的类白血病反应的NAP活性极度增高。

②急性粒细胞白血病时NAP积分值减低，急性淋巴细胞白血病的NAP积分值多增高，急性单核细胞白血病时一般正常或减低。

③再生障碍性贫血时NAP活性增高，阵发性睡眠性血红蛋白尿症时活性减低。

3）其他血液病：慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性肿瘤（真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化症）NAP活性中度增高。

4）腺垂体或肾上腺皮质功能亢进，应用肾上腺皮质激素、ACTH、雌激素等NAP积分值可增高。

 

3、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（AS-D NCE）——胞质红色沉淀

也称特异性酯酶、粒细胞酯酶——主要存在于粒系细胞中。

结果：

胞质中出现红色沉淀者为阳性反应。

原始粒细胞为阴性反应或弱阳性反应，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均呈阳性反应，早幼粒细胞呈强阳性反应，酶活性随细胞的成熟而逐渐减弱。

嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、浆细胞、幼红细胞——阴性反应。

临床意义：

急性粒细胞白血病呈强阳性反应，急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病均呈阴性反应。

急性粒、单核细胞白血病呈阳性反应、阴性反应共存。

4、糖原染色——胞质紫红色化合物

也称过碘酸希夫反应（PAS反应）。

结果：

胞质中出现红色者（颗粒、小块或弥散均匀红色）为阳性反应

Ø  强阳性、阳性、弱阳性和阴性。

①粒系细胞中原始粒细胞为阴性反应，自早幼粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性反应，并随细胞的成熟，阳性反应程度渐增强。

②巨核细胞和血小板均呈阳性反应，且巨核细胞的阳性反应程度随细胞的发育成熟而增强。

③单核细胞呈弱阳性反应。

④淋巴细胞大多呈阴性反应，少数弱阳性。

⑤幼红细胞和红细胞均呈阴性反应。

临床意义：

1）纯红白血病时病理性幼红细胞呈强阳性反应，有助于与其他良性红细胞疾病的鉴别。

2）PAS反应对三种急性白血病类型的鉴别有价值。

急性粒细胞白血病：原始粒细胞呈阴性反应或弱阳性反应，阳性反应物质呈细颗粒状或均匀淡红色；

急性淋巴细胞白血病：原始和幼稚淋巴细胞常呈阳性反应，阳性反应物质呈粗颗粒状或块状；急性单核细胞白血病：原始、幼稚单核细胞大多为阳性反应，呈弥散均匀红色或细颗粒状。

3）其他：巨核细胞呈阳性反应，有助于识别不典型巨核细胞。

骨髓转移的腺癌细胞PAS呈强阳性。

 

5、铁染色/普鲁士蓝反应——含铁部位有蓝绿色沉淀

人体内的铁的贮存形式：

①骨髓中的单核-巨噬细胞胞质铁蛋白和含铁血黄素。

②幼红细胞线粒体中含有亚铁血红素。

结果：

1）细胞外铁 即幼红细胞外的铁

阳性反应为骨髓小粒上见到蓝绿色均匀的无形物质，或蓝绿色的小珠状、粗颗粒状或蓝黑色的小块物质，按阳性反应的强度分为5级：

“-”骨髓小粒无蓝绿色显现（提示骨髓贮存铁缺乏）。

“+”有少量铁颗粒，或偶见铁小珠。

“++”有较多的铁颗粒和铁小珠。

“+++”有很多铁颗粒、小珠和少数蓝绿色小块。

“++++”有极多的铁颗粒和小珠，并有很多密集成堆的小块。

2）细胞内铁 即幼红细胞内的铁。

含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼红细胞。

正常幼红细胞（晚幼红细胞为主）核周可见到1~5个蓝绿色细小铁颗粒。

油浸镜下连续计数100个幼红细胞，记录铁粒幼细胞所占的百分率。

Ø  如含蓝绿色铁粒≥5个，并环绕细胞核排列≥1/3周者，称环形铁粒幼红细胞。

参考值：

细胞外铁+~++，大多为++。

细胞内铁20%～90%，平均值为65%，无环形铁粒幼红细胞。

临床意义：

1）缺铁性贫血，细胞外铁呈“-” ，铁粒幼细胞百分率减低。

铁剂治疗，细胞内铁数天即可纠正，但细胞外铁需补铁治疗一段时间后才会出现。

铁染色是目前诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的一项可靠和临床实用的检验方法。

2）非缺铁性贫血，细胞外铁多增加。

Ø  慢性炎症性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、铁粒幼细胞性贫血、溶血性贫血、巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血及骨髓病性贫血。

3）铁粒幼细胞性贫血，铁粒幼红细胞增多，可见到环形铁粒幼红细胞（＞15%）。

 

了解：

一、骨髓细胞学检测的临床应用

1、诊断造血系统疾病

2、辅助诊断某些疾病

3、提高某些疾病的诊断率

 

二、血细胞的常见细胞化学染色

1、α-乙酸萘酚酯酶染色（αNAE）——胞质有色沉淀

也称非特异性酯酶、单核细胞型酯酶——主要存在于单核系细胞

结果：

胞质中出现有色沉淀者（灰黑色或棕黑色）为阳性反应。

原始单核细胞为阴性反应或弱阳性反应，幼稚单核细胞和单核细胞呈阳性反应。

粒系细胞一般为阴性或弱阳性反应。

淋巴细胞一般为阴性反应。

临床意义：主要用于急性单核细胞白血病与急性粒细胞白血病的鉴别

急性单核细胞白血病呈阳性或强阳性反应。

Ø  但单核细胞中的酶活性可被氟化钠抑制，故常同时做氟化钠抑制试验。

急性粒细胞白血病呈阴性反应或弱阳性反应，其阳性不被氟化钠抑制。

 

三、细胞免疫分型

单抗、抗原特异性结合。

1、检测方法

1）免疫荧光法

有荧光——阳性

无荧光——阴性

2）免疫酶标染色法

APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶）

显示颜色——阳性

无颜色——阴性

2、细胞免疫分型的临床应用

1）有助于识别不同系列的细胞。

识别髓系细胞的抗体：CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD33、CD64、CD117。

识别T细胞系列的抗体：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD57。

识别B细胞系列的抗体：CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、FMC7、CD79a、IgM、Kappa和Lambda轻链。

识别NK细胞的抗体：CD16、CD56。

识别巨核细胞和血小板的抗体：CD41、CD42、CD61。

识别幼稚红细胞的抗体：血型糖蛋白A（CD235a）、CD36、CD71。

2）用于检测T淋巴细胞亚群

常用CD3、CD4和CD8单抗检测全T细胞，并可将T细胞分为Th和Ts两个主要亚群。

3）用于识别不同分化阶段的细胞

CD34、CD38、HLA-DR、TdT

4）有助于识别不同功能态的细胞

Tm高表达CD45RO、不表达CD45RA。

活化T细胞不表达CD45RA。

5）可用于血液肿瘤的免疫表型。

6）可用于血液肿瘤微小残留病的监测。

3、急性白血病细胞免疫表型特征

1）急性B淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤（B-ALL/B-LBL）

2）急性T淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤（T-ALL/LBL）

3）急性髓细胞白血病（AML）

 

四、细胞遗传学分析

平衡畸变：

t（8；21）（q22;q22）见于一些AML。

t(15;17)(q22;q12)见于急性早幼粒细胞白血病（APL），形成PML-RARA融合基因——特异性分子标志物。

非平衡畸变：染色体数目异常。

慢性髓系白血病（CML）特点是具有Ph染色体，即t(9;22)(q34;q11.2)，形成bcr-abl融合基因。