生物分离过程最终复习

名词解释：

反复冻融法：将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化。如此反复多次，就能使细胞壁破裂。冻结-融化法破壁的机制有两方面：一方面在冷冻过程中会促使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面，冷冻时胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。比较脆弱的菌体可采用此法，但释放的蛋白质仅为10%左右。

渗透压冲击法：先把细胞放在高渗溶液中（例如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内的水分便向外渗出，细胞发生收缩。当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂，使产物释放到溶液中。

萃取：是将萃取剂和料液放在萃取器中，经充分振荡混合，静置分层后形成萃取相和萃余相，用机械方法使互不相溶的两相分开。

反萃取：反萃取是将萃取液与反萃取剂相接触，使有机相中的溶质转入水相，可把这种过程看作是萃取的逆过程。反萃取后不含溶质的有机相被称为再生有机相，含有溶质的水溶液被称为反萃液。

有机溶剂沉淀：是指在蛋白质溶液中，加入与水互溶的有机溶剂，能显著地减小蛋白质的溶解度而发生沉淀的方法。有机溶剂沉淀法常适用于蛋白质、酶、核酸、多糖等物质的提取。

晶种：是用于在结晶过程中诱导、加速结晶的一小部分已结晶的物质。它是一种结晶的起始点，可以提供晶体结构的模板，使溶液或熔融物中的溶质分子围绕晶种排列，形成新的晶体。

结晶：是指溶质自动从过饱和溶液中析出形成新相的过程，结晶包括3个过程：形成过饱和溶液、晶核形成、晶体生长。

过饱和溶液：是指结晶过程中，溶质浓度超过溶解度时，该溶液称为过饱和溶液。过饱和溶液常用的形成方法：蒸发法、温度诱导法、盐析结晶法等。

物理吸附：是指吸附剂和吸附物之间通过分子间引力（如范德华力）而产生的吸附现象。

化学吸附：是指吸附剂和吸附物之间发生电子的转移，因化学反应产生化学键而吸附的现象。

吸附物：是指在物理或化学过程中，通过吸附作用将物质从气相或液相中吸附到固体表面上的物质。

分离度：分离度又称分辨率，是判断物质在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为柱的总分离效能指标。

脱盐：是指将蛋白质分离纯化而将其他小分子盐类除去的步骤，常用方法有：凝胶层析法、包埋法等。

离子交换法：是指利用溶液中各种带电离子与离子交换剂之间结合力的差异而进行物质分离的操作方法。

大孔型离子交换树脂：又称大网格离子交换树脂，具有大孔结构并带有功能基团的网状结构的不溶不熔聚合物，具有良好的耐磨强度和耐氧化、抗有机物污染的性能，可用于分离、提纯等。

生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗体等活性物质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力，这种识别并结合的能力具有排他性，生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用。

亲和层析：是利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的分离纯化技术。

金属离子亲和层析：是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离方法。

亲和配基：是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的基团物质。

相对离心力：是指离心力与重力的比值，表示离心机的离心能力。

沉降速度：是指在离心力的作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。

沉降系数：是指在单位离心力场中，颗粒的沉降速度。

速度区带离心法：又叫速率区带离心法。离心操作时将样品液置于连续或不连续线性或非线性密度梯度液上，控制离心时间，使所需组分穿过部分梯度液，形成的分离区带在达到其等密度区之前即停止离心。

膜分离技术：是指用膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中其他成分，从而达到分离目的的技术。

透析：是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化方法。

蛋白质复性：当蛋白质变性程度不重时，可在消除变性因素条件下使蛋白质恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为蛋白质复性。

简答题：

1、凝聚和絮凝的区别？

（1）凝聚作用：是指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。

影响凝聚作用的主要因素：无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等

常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3·18H2O、AlCI3·6H20、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。

（2）絮凝作用：当往胶体悬浮液中加入絮凝利时，胶粒可强烈地吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤，这一过程称为絮凝作用。

絮凝剂：根据所带电性不同，可分为阴离子型、阳离子型和非离子型三类。

常用的絮凝剂：壳聚糖、海藻酸钠、明胶和酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物及聚丙烯酸类等。

2、生物分离工程的特点是什么？

生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。

生物工程的主要特点是：

（1）生物制品多种多样，常无固定操作方法可循;生物材料组成非常复杂，。

（2）分离操作步骤多，不易获得高收率，培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高

（3）分离进程必须保护化合物的生理活性;

（4）生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏。

3、单级萃取和多级错流萃取的区别？

（1）单级萃取：只包括一个混合器和一个分离器。料液和溶剂先经混和器混合，达到平衡后，用分离器分离得到萃取液和萃余液。

（2）多级错流萃取：料液经萃取后的卒余液再用新鲜萃取剂进行萃取的方法称多级错流萃取。

第一级的萃余液进入第二级作为料液，并加人新鲜萃取剂进行萃取，第二级的萃余液再作为第三级的料液，也同样用新鲜萃取剂进行萃取。同理还可进行4级、5级以至n级萃取。

此法与单级萃取相比，溶剂消耗量大，而得到的萃取液平均浓度较稀，但萃取较完全。

4、什么是盐析法？盐析法的优缺点？

盐析法：是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引人定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。

优点：经济、不需特殊设备、操作简便、安全、应用范围广、较少引起变性（有时对生物分子具稳定作用，至今仍广泛用来回收或分离蛋白质（酶）等生物大分子物质）。

缺点：是沉淀物中含有大量盐析剂，且硫酸铵易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上。

5、晶体的质量指什么？如何提高晶体质量？

晶体的质量指的是晶体的物理和化学特性的质量程度。晶体质量的好坏反映了晶体制备的大小、形状和纯度三个方面。

提高晶体质量的方法：

（1）改变晶体大小：当溶液快速冷却时，能达到较高的过饱和度而得到较细小的晶体，反之缓慢冷却常得到较大的晶体。当溶液的温度升高时，结晶器铜管的晶体成核速度和生长速度铃增快，但后者的影响更显著。

（2）改变晶体形状：同种物质的晶体，用不同的结晶方法产生，虽然仍属于同一晶系，但其外形可以完全不同。外形的变化是因为在一个方向生长受阻，而在另一个方向生长加速所致。

（3）提高晶体纯度：在结晶过程中，含许多杂质的母液是影响产品纯度的一个重要因素。晶体越细小，吸附杂质越多。一股把晶体和溶剂一同放在离心机或过滤机中，搅拌后再离心或抽滤，这样洗涤效果好。

6、大孔网状聚合物吸附剂是什么？有哪些优点？

大孔网状聚合物吸附剂和大孔网状离子交换树脂具有相同的大网格骨架。其孔径远大于2~4nm，可达到100nm甚至1000nm以上，故称“大孔”。与大孔网状离子交换树脂相比，它不含离子交换树脂的功能团，仅保留了多孔的骨架，其性质与活性炭、硅胶等吸附剂相似，称为大孔网状聚合物吸附剂。

优点：与活性炭等经典吸附剂相比，大孔网状聚合物吸附剂具有选择性好、解吸容易、理化性质稳定、机械强度好、可反复使用和流体吸力较小等优点。特别是可通过不同的原料和合成条件改变其孔隙大小、骨架结构和极性，因此适用于吸附各种有机化合物。

7、吸附法的定义，特点？

吸附法：指利用吸附作用，将样品中的生物物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。

主要特点：

（1）设备简单、操作简便、价廉、安全。

（2）少用或不用有机溶剂，吸附与洗脱过程中pH变化小，较少引起生物活性物质的变性失活。

（3）天然吸附剂（特别是无机吸附剂）的吸附性能和吸附条件较难控制，吸附选择性差，收率不高，难以连续操作。但是随着人工合成的高聚物吸附剂的发展，其性能已有很一大改进。

8、凝胶层析的原理与特点？

原理：凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的，一个填料的颗粒含有许多不同大小的孔，这些孔对于溶剂分子来说是很大的，它们可以自由地扩散出入。如果对溶质分子大小合适的话，则可以不同程度地往孔中扩散，大个的溶质分子只能占有比较少的孔，而小个的溶质分子则除去能占有大孔外还可以占有另外一些较小的孔。所以溶质分子尺寸的减小可以占有的孔体积迅速增加。当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先流出的是最大的分子。

特点：

（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。

（2）分离效果较好，再复性高。

（3）分离条件缓和。

（4）应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化

（5）分辨率不高，分离操作较慢。

9、凝胶层析的操作？每步操作中的关键点？

（1）样品与上样

关键点：样品上柱

理想的样品色带应是狭窄且平直的矩形色谱带。为了做到这一点，应尽量减少加样品时样品的稀释以及样品的非平流流经层析凝胶床体。加样时应尽量减少样品的稀释及凝胶床面的搅动。可以直接将样品加到层析床表面或利用两种液体比重不同而分层的原理来实现。

（2）洗脱与收集

关键点：洗脱剂的流速

洗脱剂的流速对分离效果有很大影响，流速不宜过快且要稳定。

（3）凝胶柱的再生

关键点：反冲

对流速下降的板结凝胶柱，最简单的处理法是反冲，适当的反冲后往往可以恢复原来的流速。

10、离子交换树脂的结构？离子交换树脂的基本要求？

由三部分构成：

（1）惰性的不溶性的高分子固定骨架，又称载体

（2）与载体以共价键联结的不能移动的活性基团，又称功能基团

（3）与功能基团以离子键联结的可移动的活性离子，亦称平衡离子。

基本要求：

（1）有尽可能大的交换容量

（2）有良好的交换选择性

（3）化学性质稳定

（4）化学动力学性能好

（5）物理性能好

11、亲和层析的原理？亲和层析对载体的要求？

原理：是一种基于生物大分子之间的特异性相互作用原理进行纯化和分离的层析技术。它利用固定在色谱基质上的配体与目标生物分子之间的亲和相互作用，实现目标分子的选择性捕获和纯化。

对载体的要求：

（1）载体必须能充分功能化，载体要具有足够数量的功能基团，或能方便地引入多个化学活性基因，以供与配基进行共价连接之用。

（2）载体必须有较好的理化稳定性和生物惰性，尽量减少非专一性吸附。

（3）载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。同时，亲水性还有助于亲和对达到亲和平衡，并减少因疏水相互作用造成的非特异性吸附。

（4）载体应具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过。

（5）理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球，这样在层析柱中才能保持良好的疏通。

12、等密度区带离心法的原理，及特点？

原理：在离心力作用下，不同密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动，当移动至其密度与介质密度相等的位置便不再移动，形成静止区带，即“达到”离心平衡。区带的位置即该组分的“等密度点”。

特点：

（1）加样位置不均。

（2）离心平衡后，区带的位置、形状、不受离心时间影响。

（3）梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度。

（4）分离依据是颗粒组分间“浮力密度”的差异，与颗粒大小，形状无关。

（5）离心力大小，组分颗粒的大小和形状，介质密度梯度的斜率和形状，黏度影响离心时间和分辨率（区带宽度）。

计算题：

洁霉素在20℃和pH=10.0时表观分配系数（丁醇/水）为18。用等量的丁醇萃取料液中的洁霉素，计算理论收率？若改用1/3体积丁醇萃取，计算理论收率？

（1）用等量的丁醇萃取料液中的洁霉素，理论收率：

萃余率：φ=萃余液中溶质总量/原始料液中溶质总量×100％=1/（E+1）×100％

理论收率：1-φ=E/E+1×100％=18/18+1×100％=94.7％

（2）改用1/3体积丁醇萃取，理论收率：

萃取相E=18×（1/3）/1=6

理论收率：1-φ=6/6+1×100％=85.7％

选择题：