OTUD7B去泛素化LSD1以控制其结合伴侣蛋白的特异性、体内平衡和乳腺癌转移

写在前面

        今天推荐的是由厦门大学生命科学学院在2021年5月29日发表于Advanced Science （2020IF：16.807，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Han You教授，研究表明OTUD7B去泛素化LSD1以控制其结合伴侣蛋白的特异性、体内平衡和乳腺癌转移。

研究背景

        在人类癌症中经常发现OTUD7B的基因组扩增。但它在肿瘤发生中的作用却知之甚少。已知赖氨酸特异性去甲基化酶1 (LSD1) 通过与CoREST/组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 形成抑制蛋白复合物来执行表观遗传调控。然而，细胞维持LSD1/CoREST复合体完整性的分子机制尚不清楚。

摘要部分

        LSD1蛋白经历K63连接的多泛素化。作者发现，OTUD7B负责K226/277残基处的LSD1去泛素化，从而动态控制LSD1结合伴侣蛋白的特异性和细胞稳态。OTUD7B缺乏会增加LSD1与K63相关的泛素化，这会破坏LSD1/CoREST复合物的形成并靶向LSD1进行p62介导的蛋白水解。因此，OTUD7B缺陷会损害全基因组LSD1并增强H3K4/H3K9的甲基化，从而深刻影响全基因表达并消除乳腺癌转移。此外，OTUD7B的生理波动调节细胞周期依赖性LSD1振荡，确保G1/S过渡。OTUD7B和LSD1蛋白在高级别或转移性人类乳腺癌中都有过表达，而任何一种蛋白的失调都与不良的生存和转移有关。因此，OTUD7B在维持LSD1/CoREST辅抑制因子复合物的完整性、LSD1周转和乳腺癌转移方面发挥着独特的伴侣转换作用。

研究内容

1.OTUD7B结合LSD1并调节其稳定性     

        LSD1的异常表达已在人类癌症中得到广泛报道。然而，对来自癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库的检查显示，总体上突变率发生率非常低。大多数癌症中其mRNA水平的变化，表明失调的LSD1信号主要是通过这种去甲基化酶的翻译后修饰发生的。为了更深入地了解LSD1泛素化的生理调节，作者筛选了一个由 100 个已知或推定的DUB组成的DUB库。除了USP22和USP28，异位OTUD7B也与内源性LSD1结合牢固。与LSD1-CoREST复合物相比，内源性OTUD7B-LSD1复合物易于检测但丰度低得多，表明OTUD7B可能以瞬时方式与LSD1相互作用。OTUD7B和LSD1的核共定位通过免疫荧光 (IF) 染色进一步验证。值得注意的是，当OTUD7B和CoREST都异位表达时，作者无法检测到两者之间的任何显着相互作用。使用重组蛋白，作者得出结论，OTUD7B可以在体外直接与LSD1相互作用。作者还注意到异位表达的 WT OTUD7B显着增加了HEK293T细胞中的Flag-LSD1水平，而CI突变体却没有。相反，在几种乳腺癌细胞系中消耗OTUD7B显着降低LSD1蛋白水平，而不影响LSD1mRNA 表达。

        作者接下来通过在缺失OTUD7B的MDA-MB-231细胞中表达抗sgRNA的WT或突变体OTUD7B构建体来产生OTUD7B重组细胞系，发现只有WT OTUD7B重组能拯救LSD1的减少，表明OTUD7B的DUB催化功能是其调节LSD1所需要的。蛋白酶体抑制剂硼替佐米 (BTZ) 在OTUD7B敲低后确实恢复了降低的LSD1水平。作者还观察到在没有OTUD7B的情况下LSD1的半衰期缩短，表明OTUD7B通过阻断其蛋白酶体介导的降解来调节LSD1的稳态。

研究结论：OTUD7B通过消除其泛素化依赖性蛋白酶体降解来结合并稳定LSD1。

2.OTUD7B是一种LSD1的去泛素化酶     

        LSD1的泛素化已成为其周转的重要调控机制。为了确定Ub连接的特异性，作者用Myc标记的WT Ub或其变体之一（单个Lys-Arg替换七个赖氨酸残基，即K6R、K11R、K27R、K29R、K33R、K48R 和K63R）转染HEK293T细胞。K63R 突变导致多泛素化LSD1信号的显着丢失，而K48R显示LSD1泛素化的非常微弱的减少，表明LSD1泛素化涉及混合连接的特异性，并且主要倾向于K63连接的聚泛素链。     

        作者接下来确定OTUD7B是否调节了LSD1去泛素化。当共转染到 293T 细胞中时，只有 WT OTUD7B催化异位LSD1去泛素化。相反，OTUD7B敲低显着增强了内源性LSD1的多泛素化。另一方面，在表达K63R Ub突变体的细胞中，OTUD7B敲低未能增加LSD1泛素化。总之，这些数据表明OTUD7B是一种真正的LSD1去泛素化酶，可从LSD1中去除K63连接的多泛素化链。

        Lys226 和 Lys277，是不同物种中的两个保守赖氨酸残基，为了进一步证实这两种赖氨酸在LSD1泛素化中的作用，作者通过用精氨酸替换赖氨酸构建了双取代突变体-LSD12KR（K226R/K277R）。质谱分析发现，与LSD1WT相比，LSD12KR几乎完全抵抗异位OTUD7B催化的去泛素化，并且多泛素化LSD12KR的基础水平也大大降低。为了探索K63连接的多聚Ub链在调节LSD1中的生理作用，作者通过敲除内源性LSD1，然后重新引入Flag-LSD1WT或Flag-LSD12KR构建体来生成LSD1重建的稳定细胞系。与LSD1WT相比，LSD12KR不仅表现出显着延长的半衰期，而且还赋予了对OTUD7B缺失诱导的多泛素化和降解的抗性。这些发现通过去除LSD1的K226和K277残基上的K63连接的多聚Ub链，确定了OTUD7B在控制LSD1稳态方面的关键作用。

研究结论：OTUD7B是一种真正的LSD1去泛素化酶。

3.OTUD7B介导的LSD1上K63连接的多聚Ub链的去除决定了LSD1/CoREST/HDACs的完整性     

        作为LSD1的关键结合伙伴，CoREST通过未知机制调节LSD1稳定性。作者首先探究OTUD7B介导的LSD1稳定是否需要CoREST。在OTUD7B缺陷细胞中，WT OTUD7B重建完全恢复了LSD1蛋白表达。然而，当内源性CoREST不存在时，这种恢复作用完全减弱。另一方面，单独由CoREST缺失引发的LSD1不稳定未能在CoREST和OTUD7B同时缺失后进一步减少。结果显示CoREST和OTUD7B可能通过相同的机制调节LSD1的稳定性，特别是通过调节K63相关的LSD1泛素化。与OTUD7B缺失类似，CoREST的缺失导致LSD1的K63连接的多泛素化显着增加。然而，在LSD1重建细胞中，LSD12KR仅对CoREST缺失引起的不稳定表现出显着的抵抗力。与这些观察结果一致，LSD12KR重建细胞中的CoREST缺陷仍然能够促进LSD1的K63连接的泛素化。这些数据提出了CoREST可能通过阻止K226/277和其他残基上的K63连接的LSD1多泛素化来调节LSD1稳定性的可能性。

        泛素化通常调节不同的细胞过程。作者推测，LSD1的K63连接的多泛素化还可能会调节其与CoREST/HDACs复合物的关联。作者检查了敲低OTUD7B的细胞中的内源性LSD1/CoREST/HDACs 复合物丰度。BTZ处理阻止了LSD1降解，但没有恢复OTUD7B缺陷细胞中LSD1/CoREST/HDACs 复合物的数量，表明 K226/K277 残基上的K63连接泛素化确实消除了LSD1与这些结合伙伴的关联。结果表明OTUD7B介导的LSD1去泛素化与其对CoREST/HDACs 复合物的结合亲和力之间存在因果关系。

研究结论：OTUD7B介导的LSD1上K63连接的多聚Ub链的去除决定了LSD1/CoREST/HDACs的完整性。

4.LSD1的K63连接的多泛素化通过促进与p62的相互作用促进其蛋白酶体降解     

        作者进行了基于细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记 (SILAC) 定量蛋白质组学分析，以发现参与LSD1蛋白水解的潜在结合伙伴。在LSD1共免疫沉淀物中鉴定中，p62被证明是基于标准化SILAC比率的结合伙伴之一。p62已被证明优先识别K63连接的多聚Ub链。作者发现，p62敲低完全减弱了由OTUD7B或CoREST丢失引发的LSD1降解。这些数据表明p62是LSD1的蛋白水解降解所必需的。

        有趣的是，敲低OTUD7B或CoREST似乎显着促进了p62-LSD1复合物的形成。为此作者通过敲低内源性p62然后回补抗shRNA的p62WT或p62F406V生成p62重建细胞。OTUD7B或CoREST敲低仅导致p62WT细胞中的LSD1降解，但不会导致p62F406V细胞中的LSD1降解，这表明与LSD1上的多聚Ub链的结合对于由OTUD7B或CoREST缺陷引发的p62介导的LSD1降解是必不可少的。LSD1的K63连接泛素化对p62表现出更强的结合亲和力，表明K63连接的多聚Ub链在促进LSD1-p62复合物形成中起关键作用。正如预期的那样，只有WT p62与K63连接的LSD1相关，进一步强调了K63连接的多泛素化对促进LSD1与p62相互作用的重要性。一致地，在LSD1重建细胞中，OTUD7B缺陷仅促进p62与LSD1WT 的相互作用，但不促进与LSD12KR的相互作用。在CoREST敲低后，在LSD1重建细胞中获得了类似的结果。使用p62F406V重构细胞，作者进一步证实了LSD1对CoREST/HDAC 的结合能力在OTUD7B缺陷细胞中大大降低。

研究结论：LSD1的K63相关泛素化，由OTUD7B或CoREST的敲低触发，通过p62将LSD1靶向蛋白酶体降解。

5.OTUD7B对LSD1动态变化的依赖性调节对细胞周期的进展至关重要

        作者随后研究OTUD7B-p62轴是否负责LSD1泛素化和整个细胞周期的降解。作者发现随着细胞进入细胞周期，OTUD7B沉默完全减弱了动态LSD1波动。此外，与表现出波动表达模式的LSDWT水平不同，LSD12KR在整个细胞周期中保持不变。这些数据强烈支持OTUD7B介导的LSD1去泛素化对其细胞周期依赖性波动的生理影响。重要的是，p62敲低完全阻止了LSD1在释放到G1阶段后减少。总之，这些结果确立了K63相关的LSD1泛素化在细胞周期进程中通过p62调节其周转的关键作用。

        作者推测K63相关的LSD1泛素化也可能在细胞周期中发生振荡。事实上，在G2/M 同步的细胞中，K63连接的多泛素化LSD1大大减少，但一旦细胞进入G1期，则显着增加。使用表达WT-Ub构建体的细胞获得了类似的结果。这些数据强烈表明LSD1的K63连接的多泛素化的波动动态控制其在整个细胞周期中的稳定性。鉴于细胞周期进程中OTUD7B对LSD1的动态和严格调节，作者接下来探究OTUD7B敲低是否会影响细胞周期。具有OTUD7B或LSD1敲低的细胞在同步后未能在G2/M停止。作者接下来检查了LSD1重建细胞中OTUD7B敲低时的细胞周期分布。与LSD1WT重建相比，LSD12KR表现出对OTUD7B缺陷诱导的G1期停滞的抵抗力，表明K226/277处LSD1的K63连接多泛素化是G1/S过渡的决定因素。

研究结论：OTUD7B对LSD1波动的依赖性调节对细胞周期的进展至关重要。

6.OTUD7B以依赖LSD1的方式调节基因转录     

        由于OTUD7B调节LSD1/CoREST辅抑制因子复合物的完整性，作者推测OTUD7B可能影响LSD1的基因组占有率和H3K4me2修饰染色质的富集。作者首先通过ChIP测序获得LSD1染色质分布模式的全局视图，发现大多数LSD1结合信号富集在MDA-MB-231细胞的内含子或基因内区域。在OTUD7B敲低后，43872个LSD1峰中约有16%显示出LSD1信号的显着丢失，这表明OTUD7B在调节整个基因组的LSD1结合中起着关键作用。

        作者随后在敲低OTUD7B或LSD1的MDA-MB-231细胞中进行RNA-seq分析。LSD1和OTUD7B调节的转录组之间的重叠基因的通路分析显示，大部分与“细胞周期”和“细胞分裂”相关。作者关注启动子在OTUD7B敲低后失去LSD1占据并获得H3K4me2的基因。使用该标准，分别鉴定了258个OLco阴性和274个OLco阳性调节基因。共有11个 OLco调控的基因与“肿瘤发生和细胞周期调控”相关。作者通过定量ChIP在OTUD7B敲低后观察到LSD1结合信号的显着丧失和 H3K4me2 标记在这11个基因的启动子处的积累。作者还发现使用H3K9me2抗体的ChIP qPCR检测在细胞周期蛋白D1、CDK6和snail启动子处检测到H3K9me2信号急剧增加。因此，OTUD7B-LSD1轴的变化导致激活和抑制染色质修饰标记的变化，可能是OTUD7B缺失而改变的基因转录的机制。作者随后分析了LSD1重建细胞中所选11个基因的LSD1结合和 H3K4me2/H3K9me2水平。对其mRNA水平的验证表明，与LSD1WT重建相比，LSD12KR 赋予对OTUD7B敲低诱导的转录物表达改变的抗性。此外，对于这些基因，其蛋白质表达模式的变化与转录水平的变化非常一致。重要的是，在LSD1重建的细胞中，LSD12KR使它们的启动子对OTUD7B确实诱导的 H3K4me2/H3K9me2 改变具有抗性。这些结果突出了OTUD7B介导的LSD1去泛素化在调节其基因组占有率和基因转录调控中的关键作用。

研究结论：OTUD7B以依赖LSD1的方式调节基因转录。

7.OTUD7B通过LSD1促进转移     

        LSD1与促进癌症转移有关。作者接下来进行了脂肪垫注射，然后进行了定量生物发光成像分析。与LSD1敲低类似，OTUD7B敲低显着损害了LM2细胞的肺转移。同样，当OTUD7B缺失时，LSD12KR细胞赋予对转移潜能丧失的抵抗。作者接下来探讨了OTUD7B-LSD1信号传导的临床意义。在人类癌症中发现了增加的OTUD7B转录水平。免疫组织化学 (IHC) 染色检测到405例乳腺癌样本中OTUD7B和LSD1的蛋白表达显着升高，与其组织学分级密切相关。

        这些观察结果促使作者探索基于OTUD7B/LSD1介导的基因表达特征促进转移的信号通路的富集。为此，作者利用来自人类癌症转移数据库（HCMDB）的数据进行基因集富集分析（GSEA）。使用OLco调节的基因集显示，OTUD7B或LSD1的缺失导致转移基因的表达显着降低解释了由于OTUD7B-LSD1信号传导受损而抑制转移能力。该结果还表明，这些蛋白质的异常高表达水平可能对乳腺癌患者的肿瘤分级和淋巴结转移具有预后意义。在 277名患者的队列中，OTUD7B和LSD1的IHC染色显示这两种蛋白质在基底样亚型中的染色强度要强得多。对来自METABRIC的已发表基因组数据的进一步检查显示，与其他亚型 (273/1399) 相比，基底样亚型中OTUD7B(57/209) 拷贝数增加的频率显着增加。与这一发现一致，具有高OTUD7B表达的基底样乳腺癌患者的生存率较低，表明异常的OTUD7B表达可能是基底样乳腺癌患者预后预测中潜在有用的生物标志物。

研究结论：OTUD7B通过去泛素化LSD1促进转移，另一方面失调的OTUD7B/LSD1轴的临床相关性，这可能作为乳腺癌患者生存结果不佳的潜在预后标志物。

结论与讨论

        在这里，作者发现OTUD7B，一种属于DUB的卵巢肿瘤(OTU)家族的去泛素化酶，负责LSD1去泛素化。据报道，OTUD7B催化包括细胞周期蛋白B、极光A、表皮生长因子受体(EGFR )、Sox2、Zap70和TRAF3。OTUD7B的基因组扩增在人类癌症中经常发现。但人们对这种去泛素化酶在肿瘤发生中的作用知之甚少。作者的数据揭示了OTUD7B通过调节LSD1稳定性及其组装成辅抑制因子复合物在基因转录、细胞增殖和癌症转移中的关键作用。

Thank you!

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34050636/