定量单细胞蛋白质组学是如何表征细胞层次探究血液疾病呢？

前言

在过去的几年里，RNAseq（sc-RNAseq）等单细胞分子方法彻底改变了我们对分子细胞生物学的理解。虽然该方法提供了很多生物系统的RNA信息，也证明了较高的临床相关性，但是它的数据代表蛋白质水平的能力是有限的。

2021年6月，丹麦哥本哈根大学健康科学学院 John E. Dick&Bo T. Porse课题组在Nature communications期刊上发表了的题为“Quantitative single-cell proteomics as a tool to characterize cellular hierarchies”的研究文章，基于LC-MS的蛋白质组学方法对白血病细胞层次结构进行了单细胞分析。为使用scMS研究原发性白血病和其他血液相关疾病铺平了道路。

中文标题：利用定量单细胞蛋白质组学表征细胞层次结构

研究对象：细胞系

发表期刊：Nature Communications

影响因子：14.919

发表时间：2021年6月7日

基于LC-MS的单细胞蛋白质组学（scMS）想要成为sc-RNAseq的可行替代品，作者认为需要满足以下三个条件：

（1）能够在合理的时间范围内处理数千个细胞；

（2）就检测到的蛋白质数量而言，覆盖一个相似的数量级；

（3）在广泛的细胞系统中易于实施。

因此，作者开发了一种scMS实验流程，在通量和蛋白质组深度方面都优于现有的scMS方法。为了检验新开发的实验流程能否检测复杂细胞混合物中的与生物学相关的细胞异质性，作者使用原发性急性髓系白血病（AML）培养模型进行实验。

研究思路

研究结果

实验工作流程

首先，将单细胞FACS（荧光激活细胞分选术）分选到包含裂解缓冲液（基于三氟乙醇）的384孔PCR板中的单个孔中，并记录下每个单独单元的FACS参数，在数据分析时对其进行整合。接下来，通过板内冷冻和煮沸裂解细胞，并在过夜消化后，使用16-plex TMTPro技术标记单细胞。在下一步骤中，将14个单细胞与助推器中的等效的200个细胞混合在一起。最后，在LC-MS分析之前使用真空离心干燥样品。

图1 | scMS 工作流程的实验概述

评估基于升压器的 scMS 工作流程的定量性能

由于来自单细胞的肽量很低，因此必须在单细胞通道中达到足够的信噪比（s / n）来确保定量的准确性。在基于Orbitrap的仪器上，一般通常通过使用长注入时间（IT）和高的相应的自动增益控制（AGC）显示参数来实现。通过注射时间（IT）对单细胞信号影响，增加离子采样的影响，蛋白质log2 s/n值及其CV的密度等多个方面结果的比较（图1），最终认为300 ms和500 ms都可能产生具有生物学意义的数据，并且当应用于真实的scMS样品时，这两种设置都在蛋白质组深度和定量性能之间取得了良好的平衡。

图2 | 评估基于booster的scMS工作流程的定量准确性

SCeptre，一个用于分析scMS数据的计算工作流程

为了能够评估实验工作流程的查询能力以及“中”（300 ms）和“高”（500 ms）仪器参数的影响，作者分析了每种方法的24个样品，并使用新开发的SCeptre包来处理scMS数据。作为输入，SCeptre从蛋白质组发现器和单个细胞的元信息中获取结果文件，这是将记录的FACS参数链接回每个细胞的关键。总的来说，SCeptre为scMS数据分析提供了一个框架。

scMS 能够检测 AML 层次结构中的细胞异质性

接下来，作者测试了该流程检测OCI-AML8227模型系统中已知异质性的能力。比较了“高”（500ms）和“中”（300ms）两个数据集，发现它们都能够对异质性进行很好的分离（图2a）。但是“高”方法在分离功率（轮廓系数）方面优于“中”方法（图2b）。总体而言，与批量测量相比，scMS测量的FC值往往要低，这表明动态范围有限，但是“高”数据集的结果似乎受到这些问题的影响较小。

图3 | 使用“中”和“高”方法检测细胞异质性

从 scMS 数据中提取生物信息

因为“高”方法的定量准确性更高，所以使用该数据集的数据进行生物学研究。作者将原始细胞（BLAST）和白血病干细胞（LSC)和祖细胞（PROG）的组合进行对比，找出了差异表达的蛋白。差异蛋白的基因富集分析显示：与蛋白质翻译相关的条目在白血病干细胞（LSC)和祖细胞（PROG）组合中被富集，与髓系分化相关的条目在原始细胞中富集。总的来说，这些结果表明分化阶段的分离是由生物学上有意义的蛋白质信号驱动的，并且该工作流程能够发现其中一些变化的蛋白质。

图4 | 从scMS数据中提取生物信息

基于无偏发现的多重单细胞蛋白质组学

总的来说，这一分析证明了scMS在细胞沿分化轨迹排列方面的能力，并暗示了存在两条平行分化路径的可能性（图4）。为了直接测试LSCs趋向成熟的CD34-CD38−原始细胞存在两种不同分化途径的可能性，研究者对LSC和祖细胞进行了分类，并评估了它们在培养物中10天的分化情况（图5），结果支持了LSCs可能存在两种截然不同的分化途径。这证明了scMS分析在揭示新的生物机制方面的能力。

图5 | scMS概括分化轨迹

图6 | OCI-AML8227培养系统的FACS分化测定

基集成不平衡的 scMS 数据集

作者使用Scanorama对scMS数据集进行无监督批量校正。为了进一步增加LSC和祖细胞的数量，作者测量了另外一个384孔板，并使用SCeptre将两个预富集板块的数据集成到一个数据集中，形成了一个包含2514个细胞的917个蛋白质的数据集。扩散图显示了与大部分数据集相似的结果（图6），但LSC和祖细胞数量的增加加强了LSCs分化为祖细胞的证据。此外，还鉴定出相似的蛋白质表达特征。

图7 | 集成不平衡的 scMS 数据集

研究讨论

通过在样品制备、数据生成和数据分析上花费更多精力，作者建立了一个scMS工作流程，该工作流程能够实现：（1）大约能量化每个细胞的1000个蛋白质，（2）每天仪器时间能够分析超过一百个细胞，（3）使用最先进的单细胞计算算法对数据进行归一化，过滤，集成和可视化，（4）检测细胞的异质性和特异性蛋白质。

总之，这项工作首次使用基于LC-MS的蛋白质组学方法对白血病细胞层次结构进行了单细胞分析。该实验通过AML模型证明了，可以使用蛋白组学数据来概述FACS 数据。虽然本实验只专注于单个患者的白血病，但它仍然是随后研究的良好资源，并为使用scMS研究原发性白血病和其他血液相关疾病铺平了道路。

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大规模单细胞分析对于捕获复杂细胞系统中的生物异质性至关重要，但仅基于RNA技术的单细胞转录组学数据并不能很好地代表蛋白质水平上的变化。而单细胞蛋白组学技术能够从蛋白质水平上破译细胞机制并且获得更多的信息。

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