(RESEARCH LIFE) 因为一个甲基而走上的药物化学之路
折腾了两年的一篇文章终于被CCL接受了。
最开始的时候，这篇文章我只想水一篇（指灌水）影响力比较小的普通期刊。当时是筛选了一批来自另一个课题组的老师的一些化合物，得到了几个活性比较好的。虽然活性好而且得到了一些构效关系（化学结构和活性的关系），但是问题在于结构很乱（在药物化学是指一些化合物的分子结构没有规律的意思）。这种情况虽然可以满足一些普通期刊的要求，但对于逻辑性要求很高的药物化学期刊则相对较困难。所以虽然我写好了初稿，但投稿的事情最后还是让老师压了下来。
当时我主要在从事化学探针的生物评价和抑制剂筛选的工作，都是一些比较基础的活。尽管在两年前做过一些有机合成，但当时因为做得不好，被师兄说，然后留下了一些心理阴影。所以尽管我也想尝试自己合成一下，但还是没跟老师说，而是请另一个课题组的老师帮忙合成。但几个月过去，那边依然没有任何回应。为了不让这篇文章泡汤，于是我还是决定自己试着来做。尽管做得不好，但至少操作是会的，加上近两年好好地通读了几本有机化学的教材，所以也想尝试一下。
活性好的两个化合物的结构
艰难地打通第一个化合物的合成路线
在国内做有机化学的课题组，对于一个化合物的合成路线，多数人都是用“打通”来形容，可想而知，多数情况下是比较难的。尽管做药物化学的人不需要去开发新的反应，但是根据文献含糊的描述把一个实验重复出来经常不是一件容易的事。为什么说“含糊”呢？很多做化学的人在写文章时不注重方法的描述，有的时候描述甚至是错误的。在这种情况下，便只能根据有机化学的基本知识对反应体系、反应时间进行优化。此外，有机化学合成不像是分子生物学实验，后者往往会有成体系的protocol，严格按照步骤一步步进行往往都能得到很好的重复。合成实验对温度的要求，反应时间的要求，反应物的量，催化剂的量的要求，往往从一个反应到另一个反应变化很大，很少有反应能给出一个适用所有反应物的protocol。因此，针对不同的目标化合物，经常不得不去试错，而且很多时候做不出来。
目标化合物的设计，红框中为目标化合物
我这次要做的化合物是根据已经有的化合物设计的。化合物1-3都是别人提供的，其中1和2都有很好的活性（8 nM和9 nM，IC50值，用来评价药物活性，值越低表示活性越高），而3的活性则较差（400 nM）。化合物2和化合物3的结构非常像，只有一个甲基的差别（绿色虚线圈），但是活性却差了超过40倍。所以，如果把这一优势套用到化合物1上，不是能得到更高活性的分子吗？所以我的设想中便是化合物4（红框中）。但是想法和执行往往有很大的距离。化合物4并不能通过简单地用化合物1进行甲基化反应得到，因为化合物1有两个羟基，进行甲基化反应选择性会很差。所以只能用全合成的方法来制备。全合成便需要把化合物1的合成路线打通。
化合物1是别人做过的，所以有文献可以参考。这一类化合物被称作查耳酮，其骨架基本上都是通过一个叫Claisen-Schmidt反应合成的。所以，我第一步要做的，便是打通两个片段的合成路线。
Claisen-Schmidt缩合
第一个片段的合成路线
第一个片段我就遇到了困难。这个片段的合成要在酚羟基旁边上一个溴。学过高中有机化学的人大概知道，这个化合物有两个等价的位置可以被溴取代（紫色圈）。所以难点便是控制其中一个位置溴化。此外，二溴代和一溴代的产物与底物大概是很难分离纯化的，因为溴代对极性的改变不是很明显。这个中间体的合成，原作者采用的是用溶解度差异来进行纯化。因为溴化会让溶解度降低一些。我第一次投料尝试，把底物溶解在醋酸里，滴入刚好一当量液溴，然后室温下反应三个小时。最后加水析出的时候，什么晶体都没有看到。我在想是不是溶解在水里了，于是便用有机溶剂把它萃取出来。点板的时候发现它和底物的极性是几乎一样的。这个时候我就感到大概是失败了。但是还是想试试看这是不是想要的产物，于是把它纯化出来打了一个核磁谱。结果发现这果然还是底物，甚至一点产物的峰都找不到。
再次尝试反应更久，还是一样的结果。第三次，我在想，是否往里面加入一点点水会反应得更好？结果一加入，果然，立刻有肉眼可见的变化了。但是这和文献描述的不一样呀。文献描述是说加入大量冷水析出。我把这个固体抽滤出来，重结晶。最后发现它是二取代的产物。这一来就陷入了困境。没有这一个溴原子，想要合成化合物1是不可能的。但也没办法，只好暂时放下它，去制备另一边的片段。
克莱森重排反应，上面为文献中报道的产物，下面为根据原理的产物
另外一边是一个Claisen重排反应。但根据反应机理，重排后的结构按理说应该是右边的这个。但我想了很久不明白原因，只好直接按照文献做了。第一次做是相对顺利的。这个反应因为是在190摄氏度的高温下进行，产物黑乎乎的，有一股做饭时食物被烧焦的气味。它的萃取非常费力。因为担心产物损失，所以我尽可能地多萃出来一些东西了。结果得到的就是一团黑乎乎的泥一样的东西——当然，它还伴有烧焦的气味。在混入了大量硅胶并且蒸干后，终于好看了一点。
克莱森反应粗产物（上）纯化后的产物（下）
好在黑乎乎的东西都被吸附在硅胶上了，得到的产物倒是很干净，结出来的晶体很好看。这个中间体倒是一次就做成功了，收到核磁结果的时候很惊喜。
溴化的那个中间体后来发现有CAS号，而且可以在网上买到。得知这一件事的时候很欣喜，尽管10克要3300块钱，老师还是没有多问就让订了。这个中间体送到花了两三周的时间。送到的那一天，因为疫情还要去校门拿。当时接到电话高兴得直接放下手里的咖啡骑个车去签收了。拿到这个中间体之后，马上开始做后两步，很快也就得到了苯甲醛的中间体。最后便是见证奇迹的时刻，把两个片段用Claisen-Schmidt缩合连接起来。这一步也没有什么困难便做出来了。得到的终产物依然很好看。
旋蒸出来的第一个产物
路线打通之后，我便合成了一系列类似物。因为难点都在前面两个中间体了，剩下的化合物也很快就拿到了。从这一步开始，工作便从半脑力半体力劳动变成了体力劳动。也就是拿着已有的一些中间体，根据这一条已经打通的合成路线，把化合物的数量提高上去。最后得到12个化合物，活性有好有坏。设计的化合物4，最后得到的活性是4 nM，的确略微提高了。而且我把甲基换成乙基之后它再次提高到了3 nM，而换成丙基则不行了，变成23 nM。
药物化学研究是一个体力活
被纯度折腾
这一批化合物的数据齐了之后，修修整整再加上一些基础的化合物，一篇药物化学的文章成型了。但接踵而至的是更棘手的问题——纯度。一旦发表一个新合成的小分子，提供完整的氢谱、碳谱往往是最基本的条件。这些化合物虽然通过柱色谱纯化了，但它们的核磁谱都还有一些杂峰，主要集中在低场。虽然我上网查了一下发现低场杂峰有时候是可以接受的，但是看别人的氢谱的时候发现基本上没有这样的杂峰。于是担心这个杂峰会有比较大的影响。我把核磁样品拿回来再过了一遍，多数化合物的谱图基本上干净了，但是主要的那几个化合物还是有杂峰。这几个化合物便是通过Claisen重排合成的。可能因为Claisen重排那一步引入了杂质，所以一直不干净。于是便尝试重新合成。但是这一次没那么顺利了，得不到干净的Claisen重排产物。分析谱图发现目标产物存在，但是有很大量的杂质。我尝试直接用这个产物进行缩合，最后得到的查耳酮里面依然有这个杂峰。我又重做了一次，而且柱层析纯化时的每一个馏分都用液相分析，确保产物是纯的。当我把纯度98%的产物用氘代DMSO溶解打核磁时，心想这次应该可以得到赶紧的谱图了。但是结果依然是存在那几个杂峰。
带杂质的谱图
仔细思考，大概还是Claisen产物的问题，可能是“产物”里面有下面这个产物，也就是根据反应原理所推断的。而这个产物和目标产物极性几乎一致，所以极性基本一样，液相也发现不了纯度的问题。第一次做的时候反应了足够长的时间，而第二次按照文献描述的20小时反而不行了。可能在反应过程中这个化合物逐渐再次重排生成想要的那个化合物，所以反应久一些会得到更纯的产物。这一次充分地反应了一个星期，终于得到了纯净的Claisen 产物。最后，我用丢产率保纯度的方法，拿终产物用较大极性的溶剂结晶，得到了非常干净的谱图。
推测的Claisen重排杂质
干净的谱图
药物化学研究其实没那么困难，与深不见底的药理学和有机反应化学相比，往往药化的课题能看到一定的预期。但其难点便在于要对多个学科有了解。这个研究里面，起初从化学的角度我是在想给化合物1引入一个甲基就必然会像对化合物3的帮助一样大，但实际上没有。而后来进行了结构生物学和分子生物学的学习，才意识到因为羟基旁边一个巨大的异戊烯基就像一个伞一样罩着，以至于甲氧基还是羟基对其与蛋白的结合作用差别并不大。但进行药物化学的研究对于培养药学学生的能力还是很有帮助的，随着学习的进展，最后能接触的学科最后会越来越多。
原文doi：10.1016/j.cclet.2023.108405
2023年4月7日
于京都
