如何设计 QPCR 的引物

什么是 QPCR

QPCR 是一种允许实时定量产物的 PCR。 通过在每个步骤中对 PCR 产物进行标记，荧光染料可用于定量 PCR 产物。 在 QPCR 分析中可以使用两种荧光标记方法。 它们是使用荧光染料和荧光标记的探针。 荧光染料与 PCR 产物结合，而探针与 PCR 产物退火形成稳定的三链 DNA。 QPCCR 中广泛使用的荧光染料是 SYBR Green，而探针可以是 Taqman。 在 QPCR 期间使用探针检测 PCR 产物可提供更准确的结果并提高测定的灵敏度。

图 1：QPCR 的机制

如何设计 QPCR 的引物

QPCR 引物的设计对于提高检测的可靠性、准确性和灵敏度至关重要。 QPCR 引物设计指南如下所述。

1. PCR 产物/扩增子大小——PCR 产物的大小应为 50-210 个碱基对。

2. 引物长度——引物的长度应为 19-23 个核苷酸。

3. GC含量——引物的GC含量应为35-65%。

4. 熔解温度 (Tm) – 引物的熔解温度应为 60-68 °C。该测定的退火温度比引物的 Tm 低 5°C。

5. 外显子-外显子连接——当通过 QPCR 扩增 cDNA 时，引物应跨越外显子-外显子连接以避免污染 DNA 的扩增。

6. 重复和运行 – 应避免二核苷酸重复 (TCTCTCTCTC) 和重复核苷酸（例如 TAAAAAAAGC）。

7. 3' 互补性——应避免正向和反向引物 3' 末端的互补区域，以防止形成引物二聚体。

8. 3' 稳定性 – G 或 C 残基应包含在引物的 3' 末端以增加退火的稳定性。

9. GC 夹——引物 5' 端的一个或两个 GC 夹增加了退火的特异性。

10. 特异性——引物的特异性应通过 BLAST 检查

11. SNP——引物不应包含任何已知的 SNP（单核苷酸多态性）变异

在 QPCR 的引物设计中可以使用多种在线工具，例如 Primer3、Primer-BLAST、IDT PrimerQuest、Primer Bank 和 OAT。

图 2：引物二聚体的形成

引物的设计应避免在 QPCR 中形成引物二聚体。 使用荧光染料检测 PCR 产物时至关重要，因为这些染料也会与引物二聚体结合以产生假阳性结果。

结论

QPCR 用于 PCR 产物的检测和定量。 引物的设计在 QPCR 中对于提高结果的准确性至关重要。 因此，在设计 QPCR 引物时仔细遵循指南非常重要。