如何优化梯度洗脱程序？

梯度洗脱程序如何设置？

本次课程本身可能并不严谨，只是提供一个思路，不是万能公式或者套路。请注意使用条件，切勿盲目套用。虽然限制比较多，但是大家也不要太多顾虑，因为大部分都是可以直接用的。

（应对不同的检测器、不同色谱等情况，应适当调整解决方案）

梯度洗脱在反相色谱应用比较广泛，正相也有。我们以反相色谱，普通C18为例。

上节课，我们知道调整保留时间可以通过改变流动相比例来实现。

请记住以下知识点：（这不是定理，少数情况可能并不成立）

1.在反相色谱中，有机相（甲醇、乙腈等）比例越高出峰越快（早）

2.待测物在色谱柱保留的时间越长，和杂质分离效果越好

3.出峰时间越早，峰形越对称尖锐；出峰时间越晚，峰形会变宽。因此，让待测物和杂质分离，就要让待测物出峰变慢，然后峰形会随之变差。所以，这与第二个点是矛盾的，不是让出峰时间越晚就越好。

4.流动相变化速率越大，那么基线越不平稳。与基线相关的主要因素有：检测波长（荧光和紫外）、流动相、流动相变化速率（仪器条件）、色谱柱（不同品牌、不同规格）。

梯度洗脱要解决的问题（依据重要程度排序）

1.  实现峰的分离

2.  控制出峰时间

3.  基线平稳（只要不影响定量就可以，不要多度追求完全平的基线。）

现实情况复杂多变，我希望大家先花费一些时间熟悉自己要做的东西，尤其是一些标液需要衍生之后才能检测的情况。比如什么先跑单标确定出峰时间，记录一下光谱图。混标出峰的数量，能够分辨出那个峰是什么物质等等，当然是越熟悉越好，这样去优化才会更得心应手一些。如果连这些最基本的都不清楚，就别一上来就摸索梯度程序。

运用实例

8种色素标准的梯度分离方法是如何优化出来的

1.学会如何计算

注意，改变流动相或者更换色谱柱都要从头开始对梯度进行优化，改变流动相PH就等同于换了流动相。

使用如下方法进行数据采集：

第一、是用方法得出如下参数。

初始比例     5

最终比例     100

结束时间     20

第一个峰保留时间   6.128

最后一个峰保留时间   19.271

流动相变化速率   4.75   用字母S表示

流速   1.0

第二、根据公式进行计算，得出第一版的梯度方法。

F（x）=2.375x2+5x     f(x)=4.75x+5

第一个峰和第二个峰分离不是很开，7min之后出比较好。

最后一个峰出峰时间如何确定比较好？

峰宽，峰间隔，峰数量。（理想情况如下）

从谱图可以看出，两个峰相差1.2min的时候，分离度比较好，那8个峰，每个峰之间的距离是1.2，那第一峰和最后一个峰保留时间之差为7×1.2=8.4min以上就可以很好平均每个峰。

通过F（x）=2.375x2+5x计算出第一个峰出峰需要用到的有机相体积 119.827

我要第一个峰出峰时间为7min，初始比例不改变，仍然为5，那么代入F（x）=S/2×x2+5x，则119.827=S/2×72+5×7  可以算出流动相变化速率S≈3.46

代入f(x)=3.46x+5  得出7min时，有机相比例为3.46×7+5=29.2%

通过F（x）=2.375x2+5x计算出最后一个峰出峰需要用到的有机相体积    978.362

我要最后一个峰出峰时间是16 min 此时，需要代入计算的X=（16-7）min=9 min

有机相体积为 978.362-119.827=858.535   那么代入F（x）=S/2×x2+29.2x，则858.535 =S/2×92+29.2×9  可以算出流动相变化速率S≈14.71

代入f(x)=14.71x+29.2  得出16 min时，有机相比例为14.71×9+29.2=161.58%＞100%

说明16 min,最后一个峰出不来。

然后进样，得出混标的出峰图谱。

公式的由来：在同一根色谱柱，同一种流动相，不考虑柱流失和因外部因素导致的压力变化的情况下，同一个物质出峰所消耗的有机相体积应该是近似相等的。

计算前后的梯度程序对比图如下：

计算的缺陷

复杂梯度

F（x）就比较复杂，计算困难，可以运用变化速率，简单替代进行计算。或者直接运用经验。

2.根据出峰时间进行分组，然后进行微调。

分组的规则：依据出峰顺序和接近程度进行分组。不要单纯的用峰的数量来平均分组。

如何微调？

流动相变化速率S =比例之差÷时间之差

按照分组进行处理，从前到后，依次进行。

首先，进行图谱对应

3.微调结束，增加恢复初始浓度的梯度设置。

1.  为什么要验证？

因为有些流动相色谱柱平衡需要比较长的时间，这样会导致这一针的图是OK的，下一针的图又突然不行了。如果方法比较成熟，那么换色谱柱，换仪器，不同的时间，不同的人，都是可以重复出你的实验结果的。

优化对比图，说出下面两个图怎样可以更好。

进阶

如何判断需要更换流动相或者色谱柱？

第一、弱保留

普通C18测有机酸，最明显。2%甲醇增加到2.5%的甲醇，出峰时间提前了一倍。也就是我们常说的弱保留。（当然这是比较极端的情况。所以有机酸都用亲水性比较强的柱子去做，流动相也是高盐或者较强的酸。如0.1%磷酸。）

第二、分不开

无论如何调整比例，甚至使用等度，两个峰出峰时间过早或者过晚，都是黏在一起。更换流动相之后测试仍然是这种情况，就只能更换适合分离这类物质的色谱柱了。

第三、峰形差

这种情况不是特别常见，本身等度的时候峰形是正常的，换成梯度洗脱，然后实现峰的分离之后，有个别峰的峰形就变得不堪入目。如果对于图谱要求比较高的话，这种情况也只能更换流动相或者色谱柱了。

合适的梯度比例，可以减少溶剂消耗，有时一些看似差别不大的数据，放在一定条件下，可能会产生很大的影响，失之毫厘谬以千里。科研的道路更需要严谨和系统治学方法。