Day15——未折叠的XBP1对抗β-连环蛋白抑制 血管钙化
第一次读血管钙化的文章。按付老师的意思，可能想让我做瓣膜钙化。先读读吧。
不过这篇讲的是平滑肌。
血管钙化
血管钙化指钙和磷酸盐晶体在血管壁的异位沉积。
所涉及的机制包括高磷血症、钙化促进因子和抑制因子不平衡、VSMC的成骨和成骨软骨转化、基质小泡的释放、细胞外基质中磷酸钙的沉积、细胞凋亡、衰老、炎症、氧化应激、内质网应激等。
涉及的生化机制包括股形态发生蛋白（BMP）信号、Wnt/β-catenin信号、RANKL (NF-κB受体)/OPG/TRAIL (TNF相关凋亡诱导配体)通路和Notch信号通路。
XBP1
内质网应激反应有三种途径：PERK、TF6、IRE1α。XBP1属于IRE1α途径，在检测到未折叠蛋白的积累后，激活的IRE1α从XBP1u(未剪接的XBP1) mRNA中剪切26个核苷酸，导致移码并产生XBP1(剪接的XBP1)。
Result1：钙化VSMCs和动脉中XBP1u蛋白水平降低
用含有高磷酸盐的钙化培养基诱导VSMC钙化，检测到成骨标志物Runx2和Msx2显著上调。并且观察到内质网应激标志物上调。XBP1s上调，而XBP1u下调。
腺嘌呤鼠粮喂养八周产生慢性肾衰竭小鼠模型，以诱导血管钙化。同样观察到了XBP1u下调。
从接受动静脉瘘手术的CRF患者中收集桡动脉。免疫组织化学分析显示，与未钙化的CRF患者相比，有钙化的CRF患者桡动脉中XBP1u表达降低。
通过三种模型说明了XBP1u蛋白水平的降低可能与血管钙化有关。
Result2：XBP1u在体外抑制VSMC钙化
在A7r5中，沉默XBP1没有导致自发钙化，但加重了高磷饮食诱导的钙化。沉默IRE1α以降低XBP1s可以抑制钙化。
在大鼠模型上通过测定钙沉积量和染色进一步验证了XBP1u在钙化中的作用。
而过表达XBP1u可以抑制钙化
Result3：体外XBP1u缺乏促进钙化
VSMC特异性敲除XBP1加重了腺嘌呤饮食诱导的钙化。
Result4：XBP1u直接与β-catenin相互作用
在293T细胞中过表达XBP1，采用液相色谱法得到XBP1u可能结合的蛋白，与已知的血管钙化相关的蛋白对比，得到9个可能的结合蛋白。其中在Wnt信号通路中发挥关键作用的β-catenin的结合评分最高。
co-IP实验证实了XBP1u与β-catenin的直接结合。
为了确定XBP1u与beita6-catenin的结合基序，克隆了XBP1u的不同突变体。AA缺失突变体不能结合，而AP缺失突变体可以结合。（做了一系列的验证结合的实验）
Result5：XBP1u靶向β-catenin，介导泛素化蛋白酶体降解
在293T细胞和VSMC中，过表达XBP1u抑制β-catenin蛋白表达，而mRNA表达不受影响。
而敲除XBP1可以使β-catenin表达升高。
用环己亚胺抑制蛋白合成，检测XBP1u过表达时β-catenin的稳定性。发现XBP1u能够加速β-catenin的降解。
MG132是蛋白酶抑制剂，在MG132的存在下，XBP1u对β-catenin的抑制作用减轻。
在293T和VSMC中，都观察到了XBP1u促进β-catenin的泛素化水平。
SCF复合物的E3泛素连接酶复制β-catenin的泛素化降解，β-TRCP和FBXW2作为SCF复合物的底物，识别β-catenin进行泛素化。
用MLN4927抑制SCF复合物，能够消除XBP1u对β-catenin的抑制作用。沉默TRCP也能起到同样的作用。
于是得出结论，XBP1u的作用是加强β-catenin和Trcp的相互作用，促进β-catenin的降解。
Result6：XBP1u以独立于破坏复合体的方式靶向β-catenin降解
β-catenin的一般降解方式：首先被由GSK-3β、APC、CK1和轴蛋白组成的破坏复合体介导磷酸化，然后在蛋白酶体中泛素化，随后降解。
然而XBP1u不影响GSK-3β的磷酸化，并且也不与其结合。
这说明XBP1u促进β-连环蛋白降解不依赖于GSK-3β和破坏复合物。
对影响Wnt通路的激酶一一验证，结果发现什么激酶也不影响。。。
XBP1u的C端降解域直接促进β-catenin的降解，从而减轻VSMC的钙化。
DISCUSSION
本文的贡献：发现XBP1u是内源性的血管钙化抑制剂，独立于破坏复合物，直接结合并靶向β-catenin进行泛素-蛋白酶体降解。
XBP1在内皮中也具有保护作用，保护内皮细胞免受扰流诱导的氧化应激
内质网应激与血管钙化有关，但XBP1α介导的β-catenin降解与内质网应激无关
总结一下：在生理状态下，XBP1u与β-catenin结合，介导泛素蛋白酶体降解，抑制TCF转录Runx2、Msx2等基因。在钙化刺激下，XBP1u表达下调，β-catenin入核，促进TCF转录与钙化相关的基因，促进血管钙化。
一些陌生的东西：Wnt/β-catenin通路、co-IP实验、SCF复合物。打算之后再查查。
