一、概念：

核糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。

二、原理：

         是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA;未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。

         对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号;对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。

         RPA是一种有力的工具，可用于检测在总RNA混合物中特定mRNA分子的表达。尽管操作比较复杂，但是这种方法可以在一次检测中分析多达25样品。敏感性和高通量的优点使得RPA在病原体的发现中显得非常有用。由RPA得到的结果，结合普通的形态学技术有助于阐明疾病的发生过程。

三、RPA有Northern Blot无法比拟的优势：

1、量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全

2、PA比Northern Blot灵敏15-150倍，适合检测各种表达水平之基因

3、RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达

4、一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度

四、这个方法的的主要缺点如下：

1、这个实验的前提是你必须首先要把要研究的基因克隆于一个载体，要清楚插入片段的方向，该载体插入片段两侧有T3、T7或SP6的启动子位点。载体先要用合适的内切酶线性化，选择正确的体外转录试剂盒，转录出要研究的mRNA 的互补链，再纯化。总之RNA探针的制备够麻烦。

2、核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头，X片上什么都没有。

3、要用放射性同位素。从事生物研究的人谁不接触放射性物质?但是该方法中不同于一般的探针标记，体积小，防护容易。它需要做垂直板状PAGE，还要漂洗固定，粘有放射性的物质太多，如电泳的缓冲液、电泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盘。这还没有算上RNA探针标记及随后的纯化过程。