欢迎光临散文网 会员登陆 & 注册

核糖核酸酶保护实验及于Northern Blot对比

2023-08-25 10:59 作者:bili_11941002676  | 我要投稿

一、概念:

核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay,RPA)是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。


二、原理:

         是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交,标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合,形成双链RNA;未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸,而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA,免受RNA酶的消化,故该方法命名为RNA酶保护实验。

         对于32P标记的探针,杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳,用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号;对于生物素标记的探针,杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜,采用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合,X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。

         RPA是一种有力的工具,可用于检测在总RNA混合物中特定mRNA分子的表达。尽管操作比较复杂,但是这种方法可以在一次检测中分析多达25样品。敏感性和高通量的优点使得RPA在病原体的发现中显得非常有用。由RPA得到的结果,结合普通的形态学技术有助于阐明疾病的发生过程。

 

三、RPA有Northern Blot无法比拟的优势:

1、量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成,反应更加完全

2、PA比Northern Blot灵敏15-150倍,适合检测各种表达水平之基因

3、RPA通量高,同时检测多个基因,可评价他们在同一情况下的差异表达

4、一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作,加快研究速度

 

四、这个方法的的主要缺点如下:

1、这个实验的前提是你必须首先要把要研究的基因克隆于一个载体,要清楚插入片段的方向,该载体插入片段两侧有T3、T7或SP6的启动子位点。载体先要用合适的内切酶线性化,选择正确的体外转录试剂盒,转录出要研究的mRNA 的互补链,再纯化。总之RNA探针的制备够麻烦。

2、核酸酶消化时,酶量的控制困难,容易消化过头,X片上什么都没有。

3、要用放射性同位素。从事生物研究的人谁不接触放射性物质?但是该方法中不同于一般的探针标记,体积小,防护容易。它需要做垂直板状PAGE,还要漂洗固定,粘有放射性的物质太多,如电泳的缓冲液、电泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盘。这还没有算上RNA探针标记及随后的纯化过程。


核糖核酸酶保护实验及于Northern Blot对比的评论 (共 条)

分享到微博请遵守国家法律