Day16——Nidogen-2是LGR4抑制血管钙化的新型内源性配体

最后一篇。看完这篇就开始准备汇报。

Nidogen-2是200kDa的基膜糖蛋白，在维持VSMC收缩表型和抑制损伤后再狭窄中起关键作用。本篇在研究Nidogen-2在血管钙化中的作用。

Result1：Nidogen-2在钙化VSMC和动脉中的表达降低

高磷钙化培养基诱导VSMC钙化，在第3/5/7天时观察到NID2表达降低，而一些成骨标志物，例如Runx2、BMP2、Msx2表达升高。

诱导了三种动脉钙化小鼠模型，观察到了同样的情况

取血清肌酐高的患者的腹主动脉组织，染色证实Von Kossa含量减少。NID2降低与Runx2升高有显著相关性。

Result2：NID2缺乏在体内及体外均可加重血管钙化

在VSMC中，用siRNA敲低NID2并不会导致自发钙化，而加重了高磷诱导的钙化。

而在培养基中添加NID2能够缓解高磷诱导的钙化。

诱导慢性肾衰竭模型，NID2缺乏小鼠表现出更严重的钙化

这些共同表明，NID2缺乏加重血管钙化。

Result3：NID2是LGR4的新型内源性配体

将NID2与VSMC膜受体孵育，通过抗flag抗体特异性免疫沉淀的蛋白进行液相色谱串联质谱分析，得到的蛋白经过两轮GO分析，筛选出3种NID2最可能的结合的蛋白。而这三种蛋白中，只有LGR4在动脉中有表达，因此聚焦于LGR4。

LGR4是一种GPCR，属于LGR家族的B组，被认为是成骨细胞和破骨细胞分化的关键调节因子。

为了证实NID2与LGR4之间的相互作用，将Flag-NID2和His-LGR4共转染293T细胞，证实二者的相互作用。

流式分析表明，NID2与LGR4特异性相互作用，而不与LGR5相互作用。

SPR实验证明二者的剂量依赖性结合。

克隆不同区段证明结合位点

Result4：NID2通过LGR4抑制血管钙化

使用shRNA敲低LGR4，能够加重高磷诱导的血管钙化，并且完全消除NID2的保护作用。

SMC特异性敲除LGR4，能够加重高磷诱导的血管钙化，并且完全消除NID2的保护作用。

Result5：NID2通过 LGR4-Gαq-PKC信号传导抑制血管钙化

LGR4的已知配体RSPO1参与β-catenin信号传导，于是将RSPO1作为阳性对照与NID2相比，发现NID2并不具有剂量依赖性增加β-catenin表达的效果。

接下来想到NID2是否激活了LGR4的GPCR信号，BERT实验验证了NID2刺激显著诱导Gαq和Gβγ以剂量依赖的方式分离。

TGFα脱落实验：在配体刺激下，碱性磷酸酶标记的TGFα (AP-TGFα)膜结合形式的外胞域脱落并释放到条件培养基中。AP-TGFα的脱落反应几乎只发生在Gα12/13和Gαq信号的下游。

因此，NID-2可以像RANKL一样以剂量依赖的方式增加AP-TGFα的释放，表明LGR4下游的g - αq被激活。

NID-2引起的钙信号的改变可以被LGR4沉默所阻断

NID2引起的PKC磷酸化改变也可以被LGR4沉默所阻断。

但不会引起β-arrestin改变

无论是Gαq抑制剂YM254890还是PKC抑制剂Go6983，均可显著消除NID-2对高磷诱导的大鼠原发性VSMC钙化的保护作用

Result6：NID-2通过LGR4-PKCα-AMPKα1信号通路促进Runx2 SUMOylation

首先，判断PKCα是否在NID-2的下游发挥作用。与我们的假设一致，NID-2对高磷酸盐诱导的VSMC钙化的保护作用被PKCα抑制剂Go6976所消除

此外还做了一些沉默，就略去不说了。

研究这一部分的原因是观察到钙化标志物Runx2在钙化VSMC中降低，但NID-2并没有改变Runx2的mRNA水平。

先前有报道称，VSMCs AMPKα1的激活通过小泛素样修饰物(SUMO, SUMOylation)促进Runx2蛋白酶体降解并降低Runx2蛋白的表达。于是推测NID-2治疗钙化VSMCs中Runx2的减少是否由于其SUMOylation。

PKCα抑制剂Go6976可以消除这一修饰

NID-2处理下AMPK的异常激活能够被LGR4沉默和PKCα抑制剂Go6976所逆转。

综上所述，NID-2通过LGR4-PKCα-AMPKα1信号通路促进Runx2 SUMOylation，从而起到对血管钙化的保护作用。

DISCUSSION

 nidogen-2/Jagged-1/Notch3信号是否参与VSMC钙化？