文献解读|单细胞测序鉴定高亲和力新冠抗体

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文章题目：Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of onvalescent patients’ B cells

杂志名称：Cell

发表单位：北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG），首都医科大学附属北京佑安医院，病原与生物安全国家重点实验室，北京微生物研究所

发表时间：2020.05.13

主要技术：10x Genomics

Pick理由：新冠热点，单细胞热点，数据挖掘和结构预测两种方式预测中和抗体

技术背景

新冠肺炎疫情在全球快速扩散蔓延，目前感染人数已经超过750万人，死亡人数超过40万。全球科研人员都在积极努力，期望找到对抗新冠病毒的有效药物，但是目前仍没有针对新冠肺炎的特效药物批准上市。中和抗体是一类靶向病原体并阻断病原体入侵细胞的特异性免疫球蛋白，由人体免疫系统产生，可以有效阻止病毒感染细胞。在新冠肺炎肆虐全球时，分离出有效的新冠抗体是一个重要的抗役措施。研究表明，恢复期患者的血浆中含有由适应性免疫反应产生的中和抗体，对轻度和重度COVID-19患者进行治疗，均有明显临床改善作用。然而血浆不能量产，限制了这种治疗方法的广泛使用。但是从康复病人的记忆B细胞中分离出中和性单抗确实一种有前景的干预治疗方法，这种方法具有良好的可扩展性和治疗效果。以病毒表面蛋白为靶点的人源单克隆抗体对艾滋病、埃博拉和中东呼吸综合征等传染病显示出越来越多的治疗和预防效果，它们对患者的安全性和效力已在多项临床试验中得到证实，因此对新冠也可以尝试这种治疗方案。6月5日，国家药品监督管理局正式批准中科院微生物所抗疫科技攻关团队研制的新冠病毒全人源单克隆抗体的临床试验申请，I期临床试验将在健康人体内进行安全和剂量测试，这也是全球首个已经完成了非人灵长类动物实验后，在健康人群中开展的新冠肺炎治疗性抗体临床试验。这标志着具有我国自主知识产权的新冠病毒特异性抗体药物成功进入人体临床评价阶段。

主要研究成果

1. 从60名新冠康复患者外周血中富集出B细胞，通过高通量单细胞RNA和VDJ测序快速鉴定出SARS-CoV-2中和抗体。2. 鉴定出14种有效的中和抗体，其中BD-368-2中和效应最强。3. BD-368-2中和抗体对感染sars-cov-2的hACE2转基因小鼠也有较强的治疗和预防作用。4. BD-368-2中和抗体与spike-ectodomain三聚体复合物的3.8Å 冷冻电镜结构显示该抗体的表位与ACE2结合位点重叠。5. 证明SARS-CoV-2中和抗体可以根据其预测的CDR3H 结构与SARS-CoV中和抗体的相似性直接选择。在应对大流行性传染病时，通过高通量单B细胞测序可以有效地发现人的中和抗体。

实验样本

分6个批次共选取60例新冠康复病人的PBMC分离出B细胞，分别用CD27抗体和RBD蛋白分选特定类型的B细胞，进行单细胞RNA和单细胞BCR测序。CD27+富集细胞主要为记忆B细胞，生物素化RBD和S蛋白主要富集抗原结合的B细胞。经过分选后每个样本得到的B细胞数量并不多，因此采用多个样本混合的方式。经过数据处理，最终得到8,558种不同的IgG1抗原结合克隆型。

数据总览

分析内容

通过scRNA数据和scVDJ数据结合，将记忆B细胞分成了不同的亚类。图D显示了挑选克隆的标准，包括B细胞类型，富集频率，可变区域突变频率，产生的抗体类型等。一般认为表达IgG1的B细胞对病毒刺激反应强烈，且体细胞突变（SHM）频率高的细胞亲和力更强。经过筛选最后筛选出169个理想候选克隆，通过转染在HEK293细胞中表达。同时选择了47个非理想克隆作为对照。通过ELISA，表面等离子体共振等实验发现只有rbd结合单克隆抗体具有伪病毒中和作用，同时只有Kd小于或接近ACE2/RBD解离常数的单克隆抗体与RBD结合。

从丰富克隆型分离的中和单抗中，有7种具有较强的中和能力，其抗SARS-CoV-2假病毒的IC50低于0.05 mol / l。最强单克隆抗体是BD-368-2，与BD-368来自同一克隆型。为了评估它们对真实病毒的中和能力，作者使用从COVID-19患者中分离的真实SARS-CoV-2进行了血小板减少中和试验（PRNT）。在所有测试的单克隆抗体中，BD-368-2对真实病毒的效力最高，IC50为15 ng/mL。为了进一步验证PRNT显示的真实的病毒中和作用，作者使用BD-218对真实的SARS-CoV-2进行了细胞病理效应(CPE)抑制试验。在1.2的浓度下，BD-218对所有三次重复均表现出完全的病毒抑制作用。

为了评估鉴定出的中和单克隆抗体能否在体内对SARS-COV-2起到治疗干预和预防性保护作用，作者测试了BD-368-2对感染SARS-COV-2的hACE2转基因小鼠的中和效果。9只hACE2转基因小鼠分成三组，小鼠实验采用3组共9只hACE2转基因小鼠。第一组在病毒感染前24小时，将BD-368-2腹腔注射进hACE2转基因小鼠体内，检测其预防效果。治疗组在感染后2h注射BD-368-2。对照组在感染后2小时注射抗H7N9病毒IgG1抗体（HG1K）作为阴性对照。感染后5天内，每天记录每只小鼠的体重，发现对照组小鼠体重明显下降。作者通过qRT-PCR分析了5dpi时肺部的病毒载量，发现在病毒攻击前注射BD-368-2可以完全抑制SARS-CoV-2。在感染2h后注射可以明显降低病毒载量。总之，小鼠实验证明BD-368-2在体内具有较高的治疗和预防作用。

通过克隆富集筛选有亲和力的抗体是一种高效的方法，然而由于取样限制，在很多样本中，大量克隆并未出现明显富集和扩增，可能导致信息的遗漏，因此使用抗体结构预测来注释Ig-seq数据，可以更好地选择单克隆抗体。研究表面通过比较与参考中和单抗CDR3H结构的相似性选择抗体是一种有效的方法。

然而对于新冠病毒来说，目前并无可用的参考抗体。

为了解决这一问题，作者使用3.8 Å分辨率下BD23-Fab与S胞外域三聚体复合物冷冻电镜结构。在这个三维重建结构中，每个S三聚体观察到一个单一的BD23-Fab，它与原聚体B中的“下”RBD结合，且只有BD-23的重链可变区参与RBD结合。事实上，与RBD-ACE2复杂结构的比较表明，BD23-Fab与ACE2竞争与RBD的结合。这一观察结果表明，BD-23中和SARS-CoV-2的能力来自于ACE2-RBD结合的破坏，这与之前鉴定的中和SARS-CoV的单克隆抗体高度相似。综上所述，SARS-CoV和SARS-CoV-2之间的结构有高度保守性，利用SARS-CoV中和单克隆抗体的晶体结构作为参考，筛选具有相似CDR3H结构的SARS-CoV-2抗原结合克隆型来识别中和单克隆抗体也是可行的。

鉴定出的单克隆抗体的CDR3H序列与m396 (2dd8)高度同源，通过破坏ACE2/RBD结合发挥中和SARS-CoV效应。令人惊喜的是，作者发现的12个单克隆抗体中有7个表现出强烈的RBD结合亲和力，对伪SARS-CoV-2病毒具有有效中和能力。三种具有代表性的单克隆抗体BD-503、BD-508和BD-515的中和能力在真SARS-CoV-2的PRNT中也得到验证，显示出很高的中和能力。这些单克隆抗体多编码重链VH3-66/JH6或VH3-53/JH6基因片段，轻链VLK1-9或VLK1 -33/39基因片段。

使用双抗体夹心ELISA进行的表位封装实验表明，BD-503、BD-508和BD-515可能共享一个重叠的表位。还需要更多的结构分析来获得准确的表位，以确定它们是否具有较大的保守性。

小结

近日北京新冠确诊人数的增加让人们对新冠的警惕性进一步提升。作者鉴定的强中和抗体可能提供一种有效的治疗和预防方案，在hACE2转基因小鼠上的结果证明了这一点。使用BD-368-2的临床试验正在进行中。我们期待良好的临床实验结果，也期望本文中的方法可以扩展应用到其他传染病的研究与治疗中。