Worthington艾美捷木瓜蛋白酶解离系统解决方案

蛋白水解酶广泛用于细胞解离。对于某些组织，木瓜蛋白酶已证明比其他蛋白酶的破坏性更小且更有效。Lam 发现，在用于分离龟视网膜的酶中，木瓜蛋白酶产生的创伤最小。用木瓜蛋白酶从成年蝾螈视网膜中分离出完整的单个感光细胞。Huettner 和 Baughman 描述了一种使用木瓜蛋白酶从产后大鼠身上获得高产量、形态完整的皮质神经元的方法。Finkbeiner 和 Stevens 将 Huettner 和 Baughman 方法应用于产后大鼠海马的解离。木瓜蛋白酶与胎儿和出生后的大脑区域一起使用，以提供神经元的最大解离和活力。

 

艾美捷 Worthington  Papain Dissociation System 是一套试剂，旨在用于 Huettner 和 Baughman 的组织解离方法。这些材料是为了方便和简单而设计的，对偶尔使用的用户以及更有经验和经常使用的用户都很有用。每个批次都经过组织解离性能测试，并为每次解离提供新鲜制备的酶溶液。

 

试剂在正常运输过程中的预期时间内在环境温度下是稳定的，但包装应在到达时冷藏，并在使用前可在 4-8°C 下储存长达四个月。

 

 

艾美捷 Worthington木瓜蛋白酶解离系统内容：

该包装包含足够的材料，可用于解离五个单独的组织等分试样，每个试样最多 0.3 - 0.4 cm3。对于较大的组织样本，在每个步骤中按比例准备较大体积的试剂，并按照协议中所述的相同比例将它们组合起来。

 

小瓶 1

含有碳酸氢盐和酚红的无菌厄尔平衡盐溶液 (EBSS)，每包一瓶。

 

该小瓶的等分试样用于重构其他小瓶并制备稀释的抑制剂溶液。在使用之间冷藏并在每次使用前用无菌 O 2 :CO 2平衡。

小瓶 2

木瓜蛋白酶含有 L-半胱氨酸和 EDTA，每个包装五个一次性小瓶。

 

该材料经过 0.22 微米膜过滤并在高压灭菌小瓶中冻干。用 5 毫升 EBSS（1 号小瓶）重新配制的小瓶在 1 毫摩尔 L-半胱氨酸和 0.5 毫摩尔 EDTA 中产生每毫升 20 单位木瓜蛋白酶的溶液。需要短暂温育以确保完全溶解和活性。

小瓶 3

脱氧核糖核酸酶 I (DNase)，每个包装五个一次性小瓶。

 

该材料经过 0.22 微米膜过滤并在高压灭菌小瓶中冻干。用 0.5 ml EBSS（小瓶 1）复溶的小瓶产生每毫升 2000 单位脱氧核糖核酸酶的溶液。避免剧烈混合。

 

小瓶 4

含有牛血清白蛋白的卵类粘蛋白蛋白酶抑制剂，每包一瓶。

 

该材料经过 0.22 微米膜过滤并在高压灭菌小瓶中冻干。用 32 ml EBSS（小瓶 1）复溶的小瓶产生的溶液的有效浓度为每 ml 10 mg 卵类粘蛋白抑制剂和 10 mg 白蛋白。内胶塞可在复原后丢弃。该小瓶的等分试样用于每次解离。 在使用之间冷藏并在每次使用前用无菌 O 2 :CO 2平衡。在 4°C 储存时，重构后稳定。

 

还包括一张将颜色与 pH 值关联起来的卡片，用作 O 2 :CO 2平衡的指南。

 

Worthington艾美捷木瓜蛋白酶解离系统程序：

简而言之，该程序如下：解离介质的组分如前所述重构；加入切碎的组织并用O 2 :CO 2平衡混合物。通过在 37°C 下与活化的木瓜蛋白酶一起孵育，然后研磨，使组织解离。分离的细胞被沉淀，然后重新悬浮在含有卵粘蛋白（一种木瓜蛋白酶抑制剂）的培养基中。通过单步不连续密度梯度离心将完整细胞与细胞膜分离，最终将沉淀重新悬浮在适合细胞培养或流式细胞仪分析的培养基中。

 

对于那些不熟悉组织解离和细胞培养技术的人来说，两个操作值得额外解释。

 

1. 用 95% O 2 :5%CO 2

进行平衡对于解离过程中组织的存活来说，培养介质在生理 pH 值下充分氧化和缓冲是很重要的。当培养基用 95% O 2 :5%CO 2平衡时，这两个要求都得到了满足。Earle 的平衡盐溶液含有一种 pH 敏感指示染料。当它呈红色或紫色时，介质太碱性。当将组织置于木瓜蛋白酶溶液中时（步骤#4）很可能会出现这种情况，并且在 37°C 孵育之前通常需要用 O 2 :CO 2重新平衡。

 

气体不应直接鼓入任何含有蛋白质的溶液中。这会导致蛋白质起泡和变性，失去生物活性。气体可以通过无菌纤维塞（例如无菌巴斯德或容量移液管中的棉塞）进行消毒。在混合溶液的同时，将 O 2 :CO 2 连续通过液体上方的空间，直到根据试剂盒中包含的颜色表颜色指示 pH 7.2-7.4。Earle 平衡盐溶液经过预充气，但每次打开瓶子时都应使用无菌 O 2 :CO 2进行平衡。重构的抑制剂也应与无菌 O 2 :CO 2平衡每次使用前。

 

2. 研磨（通过温和的泵送作用分散细胞）。

 

这是一个关键的程序。它用于在解离混合物中孵育后分解组织碎片。如果用力过猛，细胞会被破坏；太弱，组织碎片将保持完整。在神经元组织的情况下，使用 10 ml 移液器轻轻研磨，构成以每秒约 5 ml 的速率填充和排空桶。避免使细胞悬液起泡。

 

Worthington专注于生物技术和生命科学研究，诊断，生物制药和生物加工应用的高质量纯化酶，蛋白质，核酸和试剂盒。其核心酶包括：胶原蛋白酶，脱氧核糖核酸酶I，弹性蛋白酶，木瓜蛋白酶，核糖核酸酶，胰蛋白酶等。