如何制作PCR引物

为了扩增基因组中的特定DNA片段，该特定DNA片段的两侧应同时具有正向和反向引物。因此，两种引物都应该与DNA片段两侧的序列互补。成功设计PCR引物的基本指南如下所述。

1. 正向和反向引物的方向应为 5' 至 3'。

2. 每个引物的长度应在18至25个核苷酸之间。

3. 引物的GC含量在40%至60%之间，引物3'末端存在C或G可以促进结合。

4. 引物对的熔解温度和Tm（引物的一半退火到模板的温度）应相似且高于60°C。 最大差值应为5°C。

5. 引物的3'末端应与模板DNA完全匹配。

6. 引物3'末端的最后5个碱基中应至少存在2G或C碱基（GC钳）。GC钳促进与靶序列的强结合。

7. 可以将具有5-6个核苷酸的限制性内切位点添加到引物的5'末端。

8. 在引物序列中应避免二核苷酸重复（ATATATAT）或同一核苷酸重复超过4次（ACCCC）。这会导致误引。

9. 应避免引物内同源性或引物的二级结构。应避免正向和反向引物中的引物间同源性或互补序列。这两种情况都可能形成自二聚体或引物二聚体。

10. 二聚体分析的ΔG值应在0至-9 kcal/mole之间。

许多在线工具可用于简化引物设计，例如引物3，引物X，NetPrimer，DNAstrar等。所设计引物的特异性可以通过NCBI引物BLAST或UCSC计算机PCR等工具确定。

图 1：引物 3 接口