二维凝胶电泳 (2-DE)

 

二维凝胶电泳 (2-DE) 被认为是蛋白质组学工作的有力工具。 它用于从生物样品中分离和分离复杂的蛋白质混合物。 2-DE 根据两个不同的步骤分离蛋白质：第一个称为等电聚焦 (IEF)，根据等电点 (pI) 分离蛋白质； 第二步是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），它根据分子量（相对分子量，Mr）分离蛋白质。 因此，可以分离数千种蛋白质，并获得有关 IEF 和分子量的信息。 2-DE 是一种广泛使用的蛋白质分析方法，能够一次分离数千种蛋白质。 它可以提供蛋白质/翻译后修饰 (PTM) 丰度变化的直接视觉信息。 它还可以用于其他分析，例如全蛋白质组分析、生物标志物检测、药物发现等。 成功的 2-DE 分析有几个步骤。

 

样品制备

说到样品制备，天然样品需要转化为适合第一维 IEF 的物理化学状态，并保持组成蛋白质的天然电荷和 Mr。 为了获得良好的结果，适当的样品制备必不可少。 由于蛋白质的种类和来源不同，样品制备也不同。 理想情况下，该过程将导致样品中蛋白质的完全溶解、分解、变性和还原。

 

第一维：等电聚焦 (IEF)

正如我们上面提到的，第一维根据蛋白质的 pI 分离蛋白质。 蛋白质是两性分子，它们携带的正、负或零净电荷取决于周围环境的 pH 值。 等电点 (pI) 定义为蛋白质净电荷变为零时溶液的 pH 值。 具有正净电荷的蛋白质将向阴极迁移，在达到其 pI 之前带正电荷减少。 而带负净电荷的蛋白质将向阳极迁移，带负电荷减少，直到它也达到其 pI。

 

具体而言，将蛋白质混合物加载到 pH 梯度凝胶的碱性端。 施加电场后，蛋白质根据电荷分离，集中在 pl 值等于周围 pH 值的位置。 较大的蛋白质在凝胶中的移动速度较慢，但如果有足够的时间，就会赶上带相同电荷的小蛋白质。

 

第二维：SDS-PAGE

第一维之后，第二维分离可以在平板凝胶上的平板或垂直系统上进行。 第二维通常通过SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行，这是一种根据多肽的分子量（Mr）分离多肽的电泳方法。 该方法通常包括四个步骤，包括凝胶的制备、固定化 pH 梯度 (IPG) 胶条在 SDS 缓冲液中的平衡、将平衡后的 IPG 胶条置于 SDS 凝胶上以及最后处理电泳。

 

SDS可以使蛋白质变性并以恒定的摩尔比结合到主链上。 当应用 SDS 和还原剂（如 DTT 可以裂解二硫键）时，蛋白质展开成线性链，负电荷与多肽链长度成正比。 聚丙烯酰胺形成适合分离蛋白质的网状基质。 当通过 SDS-PAGE 分离蛋白质时，较小的蛋白质由于阻力较小而迁移得更快。

 

结果可视化：染色

有多种蛋白质可视化方法，但最常用的是考马斯蓝染色和银染。 银染是一种灵敏且无放射性的方法。 银染的原理很简单。 氨基酸侧链可以与银离子结合，主要是蛋白质的巯基和羧基，然后还原为游离金属银。 结果，蛋白质条带被可视化为发生还原的点。 银染因其灵敏度（在极低的 ng 范围内）而适用于低蛋白水平。

 

考马斯蓝染色是一种相对简单的方法，比银染更定量。 适用于检测含有约0.2μg或更多蛋白质的蛋白质条带。 考马斯染料通过范德瓦尔斯吸引力与蛋白质结合形成蛋白质-染料复合物。 考马斯亮蓝染料有两种，R250和G-250。

进一步分析蛋白质。

在具有数千个点的大型研究中，几乎不可能检测到几个新点的出现或单个点的消失。 此外，通过人工比较来评估两种凝胶也是不可能的。 因此，有必要通过图像采集硬件和图像评估软件来检测差异并从凝胶中获取信息。 有一些二维凝胶分析软件，如Melanie、PDQuest、Progenesis、REDFIN等，凝胶可用于质谱鉴定等应用。