16s rRNA 分析

细菌基因具有普遍性活性和细胞功能以及极其保守的结构和核苷酸序列等不常见的特征。三种类型的细菌核糖体RNA（rRNA）根据其沉降率分为23s、16s 和5s三种，并且分别有大约3300、1550和120个核苷酸的测序长度。16s rRNA基因已成为细菌分类学分类的标准，因为它更容易和快速地测序并且包含足够的系统发育信息。

16s rRNA测序基因由八个高度保守的区域和九个可变区域组成。在整个区域中，高变区之间的保守程度差异很大，其中更保守的区域与更高级别的分类学相关，而不太保守的区域与较低级别（如属和种）相关。

相关16s rRNA 基因序列相似性的比较通常用作物种水平分类鉴定的“黄金标准”，0.5%到1%的序列差异范围通常用于描述物种分类的等级。16s RNA测序目前是微生物分类中最常用的方法，大量的和独特的16s rRNA基因序列可供比对分析。

16s rRNA测序具有以下优点：

第一，16s rRNA基因分布广泛；第二，16s rRNA基因序列丰度超过其他基因；第三，可用于测定不同类群之间的系统发育关系；第四，当扩增和测序成本负担得起时，水平基因转移不是大问题；第五，成本较低。

但是16s rRNA测序也有一些缺点：

第一，每个基因组的拷贝数可能会有所不同，但它们往往是分类单元特异性的菌株，菌株之间的变异是可能的；第二，pcr扩增偏差；第三，基因的多样性倾向于过度夸大多样性估计；第四，16s rRNA基因的分辨率通常太低而无法区分密切相关的物种；第五，测序成本下降使得微生物组学研究正在从16s测序转为通过全基因组或宏基因组学测序达到更全面的功能表征。

完整的16s rRNA 测序工作流程，包括DNA分离、制备测序、测序数据分析使用等流程。新一代测序平台每次读取覆盖100到600个碱基对，具有不同程度的准确度，但16s rRNA基因全长大约1500个碱基对，因此选择针对16s rRNA基因的引物对DNA进行选择性pcr扩增，覆盖16s rRNA基因的一部分。

目前市面上有几种引物，最常使用的是由引物27f和1492r进行扩增，然后进行sanger DNA测序或PacBio SMART测序，因为在各种高通量测序平台上，不同长度的DNA应使用相应的pcr引物 。图中显示了适合各种测序系统的引物组。

目前v1到v3区域已被确，是区分普遍存在且临床上重要的葡萄球菌属物种的最有用区域，该区域通常用于皮肤微生物组研究。

16srRNA的测序目前有多个分析平台，包括Sanger sequencing、Illumina MiSeq 、454 pyrosequencing和PacBio SMART sequencing。

以Illumina MiSeq为例，通过使用有限循环pcr进行扩增，pcr产物经过纯化、量化和合并，随后通过使用Nextera XT索引的完整补充，将illumina测序适配器和双索引条形码添加到扩增子目标中，多达96个文库可以合并在一起进行。

高通量后的测序经过过滤和修剪，得到高质量序列，然后聚类成操作分类单元（OTU）。通常基于设置的相似性阈值（通常为97%相似性）来定义OTU。聚类分析后，对OTU 进行注释，获得物种的具体分类，进而进行OTU 系统发育多样性分析和其他研究。