3.4 ROS在BCR信号转导中的作用
Wienands和Reth等人开创性工作表明，单独用过氧化氢处理就可诱导BCR信号(Wienands et al. 1996)，提示BCR信号对ROS敏感。后续的研究表明，BCR交联后一分钟即可检出ROS的产生(Singh et al. 2005)。因为发现缺乏NOX2的B细胞在BCR交联后不会立即生成ROS，故这种快速响应由NOX2介导 (Richards and Clark 2009)。基于对氢电压门控通道1(HVCN1)缺陷B细胞的研究，进一步证实NOXes在BCR信号转导中的作用。作为一种质子通道，HVCN1为NOX介导ROS的产生提供基础(Capasso et al. 2011)。具体来说，H离子作为NOX介导的ROS产生的副产品，HVCN1将其转出细胞质，以达到膜内外电荷的重新平衡（图3.1a）。HVCN1敲除的B细胞会抑制NOX2而阻碍ROS快速产生，并且伴随BCR交联出现的Syk和Akt的磷酸化水平降低，B细胞的增殖也略微延迟(Capasso et al. 2010)，展现出NOXes在BCR信号转导中的作用。然而，NOX2敲除的B细胞BCR信号却总体正常，包括细胞增殖、钙流动和Syk、Erk及Akt的磷酸化等(Richards和clark2009)。因此，NOX2介导的BCR交联后ROS的即刻产生并不影响BCR信号。考虑到HCNV1还通过NOX非依赖途径发挥功能，如嗜碱性粒细胞组胺的释放(Capasso et al. 2011)，可以合理推测其也可能通过NOX非依赖的机制干预Syk和Akt的磷酸化。
尽管BCR交联后快速产生的ROS不参与BCR信号转导，但Wheeler和DeFranco(2012)证明了ROS产生过程延长的潜在影响。他们在BCR交联6小时后利用一种靶向线粒体超氧化物的指示剂检测到该细胞器内ROS的产生，且持续清除ROS可显著抑制Akt通路并限制交联后48小时B细胞增殖。以上结果说明线粒体ROS生成延长可能涉及BCR交联诱导的B细胞活化。
最近我们证实了长时程ROS产生在BCR交联诱导的B细胞增殖中的重要作用(Feng et al. 2019)。当小鼠脾B细胞BCR交联后，ROS的产生可分为两大阶段。首先是BCR交联后立即开始至一小时后停止；其次一轮ROS的产生在交联后2小时重新开始，且这一过程持续4-6小时（图3.3a）。交联后6h和8h清除ROS时可减少NF-κB通路和Akt的激活，但2 h内同样处理无法限制该有的激活。此外，清除交联后3h产生的ROS几乎完全抑制B细胞的增殖，清晰地表明BCR交联诱导的B细胞活化依赖ROS长时程产生。当然，不排除是因为早期ROS的产量远低于后期，导致实际是后一阶段ROS的产生调节了BCR信号。
图3.3 BCR交联诱导NOX合成ROS。(a)NOX2是BCR交联诱导早期ROS产生所必需的分子。正常小鼠脾B细胞的BCR交联可分两个阶段产生ROS。NOX2敲除B细胞0-60 min的早期ROS生成被抑制，但后期(120 min-360 min)ROS的产生几乎没有变化。(b和c)NOX3参与BCR交联诱导的ROS后期产生。与普通BAL17细胞相比，缺失NOX3的BAL17细胞在BCR交联4 h后的ROS生成显著减少(c)，而缺失NOX1的细胞差异不显著(b)。实验结果基于ROS敏感的荧光染料DCFDA结合流式细胞术分析得出。版权归©[2019]美国免疫学家协会所有。
与Wheeler和DeFranco等人(2012)的研究不同，我们认为NOXes在BCR交联后持续的ROS产生中发挥核心作用(Feng et al. 2019)。虽然B细胞主要表达NOX2，但我们发现B细胞也表达其他NOXes亚型，例如NOX1、NOX3和DUOX2，同时这些分子对于伴侣蛋白活性的发挥十分关键。譬如，缺乏激活DUOX1和DUOX2所需的DUOXA1和DUOXA2的B细胞，其BCR交联诱导ROS的产生几乎不变，提示DUOX1和DUOX2对于长时程ROS产生的影响几乎能够忽略。相比之下，对于缺失编码NOX1-4激活所需p22Phox的Cyba基因的B淋巴瘤细胞株BAL17，BCR交联诱导的长时程ROS产生显著减少，结合NOX2敲除小鼠脾B细胞在BCR交联后ROS持续产生恒定，故能暂且排除NOX2的影响（图3.3a）。基于此，我们利用NOX1或NOX3缺失的BAL17细胞发现，实际仅当缺乏NOX3而非NOX1时，BCR交联后ROS的持续产生才发生显著减少，表明NOX3在BCR交联诱导的ROS长时间产生中起核心作用（图3.3b和c）。综上，NOX3可能通过在BCR信号转导的晚期产生ROS，于B细胞活化过程中扮演重要角色。
目前有关ROS在BCR信号转导中的作用的研究还很不多，甚至已有的文章还可能存在某些争议。尽管如此，现在很清楚的是，ROS在BCR信号转导中起着至关重要的作用。NOX2在BCR交联后能立即产生ROS，但早期生成的ROS可能由于含量有限，不会调控BCR信号(Richards And Clark 2009)。相反，后期诱导更高水平的ROS产生，是影响BCR信号继而激活B细胞所必需的(Feng et al. 2019)。我们最近的结果表明，ROS的持续产生与NOX3有关(Feng et al. 2019)。因此猜测，BCR交联后依次激活NOX2和NOX3，对应早期和后期ROS的形成，尽管其中时序调控的分子机制尚不清楚。有研究发现内耳中NOX3表达高，且与加速度和重力感知息息相关(Bedard and Krause 2007)。虽然NOX3在B细胞中的含量普遍较低，但低水平的表达可能足以调节BCR信号。事实上已经证实，低水平表达的NOXes在诸如心血管系统的关键脏器中发挥着关键作用(Gimenez et al. 2016)。机制角度，NOX3产生的ROS会氧化磷酸酶等信号分子使其失活，从而增强BCR信号。尽管在氧化还原体中NOX催化生成的ROS可增强细胞因子信号，但氧化还原体在早期内体中是瞬时产生的(Tsutsumi et al. 2017; Spencer and Engelhardt 2014)，目前尚不清楚是否存在更稳定的氧化还原体以干预BCR信号。有关BCR交联如何诱导NOX2和NOX3依次活化，以及NOX3介导的ROS如何增强BCR信号转导等问题仍待阐明。
SuppInfo:
DCFDA: 2’,7’–dichlorofluorescin diacetate
HVCN1: hydrogen voltage-gated channel 1
