基因工程简答题
1、碱裂解所需试剂及各自作用
1.(单选题，10 分) 碱裂解法提细菌质粒 solution I 说法错误的是：
A.葡糖糖的作用是防止细菌快速沉淀
B.Tris 的作用是提供适当的 pH 缓冲体系
C.EDTA 是为了去除二价金属离子，抑制核酸酶活性
D.solution I 要现用现配
答案解析：选择、判断、碱裂解所需试剂及各自作用（简答）
2.(单选题，10 分) 碱裂解法提细菌质粒 solution II 说法错误的是：
A.solution II 配置好以后要低温储存
B.氢氧化钠的作用是让蛋白质和 DNA 变性
C.SDS 的作用是溶解细胞膜并与蛋白结合，为下一步沉淀做准备
D.操作要快且温和，防止 DNA 断裂
答案解析：选择、判断、碱裂解所需试剂及各自作用（简答）
3.(单选题，10 分) 碱裂解法提细菌质粒 solution III 说法错误的是：
A.醋酸是为了中和碱性
B.醋酸-醋酸钾是为了提供缓冲液体系
C.钾离子可以和 SDS 反应生成不溶物
D.PDS-组蛋白-基因组可以一起从水溶液中去除
答案解析：选择、判断、碱裂解所需试剂及各自作用（简答）
4.(单选题，10 分) 碱裂解法提细菌质粒一些其他试剂说法错误的是：
A.溶菌酶可以用于水解细菌细胞壁
B.DNA 不溶于乙醇，可以利用乙醇沉淀
C.氯仿可以抢夺蛋白表面水分子，使蛋白质变性析出
D.异戊醇有助于消除气泡和维持相的稳定
答案解析：选择、判断、碱裂解所需试剂及各自作用（简答）
2、蓝白斑筛选的基本原理（α互补）
⭐ 在筛选平板上接种转化后大肠杆菌，长出的蓝色菌落是不含目的基因、转化成功的大肠 杆菌。白色菌落是含目的基因的、转化成功的大肠杆菌。而没有成功转化任何一种质粒 的大肠杆菌，会因不携带抗性基因无法在筛选平板上存活。 蓝白斑产生的原理是：大肠杆菌天生能生成β-半乳糖苷酶，转化 X-Gal 为蓝色可溶性物 质，使得菌落呈蓝色。 但用于蓝白斑筛选的大肠杆菌是β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。需要质粒、大肠杆菌二者共 同的产物，才能生成β-半乳糖苷酶。但质粒与β-半乳糖苷酶相关的基因上，有目的基因 插入的多克隆位点。因此，但载体与目的基因正确结合，β-半乳糖苷酶也无法正常生成。 根据这样的原理，我们可以根据蓝白斑区分转化成功、含正确重组质粒的菌落。
3、氯化钙转化法/冻融转化法/热激转化法的原理
利用钙离子中和 DNA 分子和细胞膜所带负电荷（降低双电层厚度），并利用低温低渗 的氯化钙溶液，让细胞处于球形（比表面积最大），从而吸附更多 DNA，即该状态下 细胞处于感受态。瞬时加热处理（热激）可以导致细胞膜快速膨胀出现缝隙，从而使细 胞表面吸附的 DNA 进入细胞，完成转化。因关键试剂是氯化钙，所以称氯化钙法；又 因有热激这一关键操作，也称热激法；又因感受态细胞储存时处于冷冻环境，使用时融 化，又称冻融法。
4、基因工程中，对于转化子的初筛、复筛各有哪些原则，可以分别用什么实验 方法达到目的⭐ 初筛——排除无载体宿主细胞——抗性基因、营养缺陷型
初筛——排除空载体转化子——双抗平板对比生长（影印法）、蓝白斑筛选、以赭石突 变为基础的颜色变化（酵母）、以琥珀突变为基础的颜色变化（酵母）、植物报告基因 筛选（GUS、GFP）
验证初筛结果——基于电泳的初步检测——提取原始/重组质粒比较大小、酶切原始/重 组质粒比较大小上的差别、对目的基因进行 PCR
验证初筛结果——基于杂交的进一步检测——利用 DNA 或 RNA 探针进行杂交验证、菌 落原位杂交
验证初筛结果——决定性证据——测序 复筛——基于实验目的的优选——直接利用实验目的筛选
复筛——目标蛋白是否存在的初步判断——蛋白电泳观察是否出现新条带或者目标位 置蛋白是否浓度提高显著
复筛——目标蛋白是否正确——western blot、菌落原位杂交、蛋白质谱
5、“转化”的基本过程 转化的基本过程：
（1）供体菌 dsDNA⽚段与感受态体菌细胞表⾯的膜连 DNA 结合蛋 ⽩相结合,其中⼀条链被核酸酶切开和⽔解,;另⼀条进⼊细胞。
（2）来⾃供体菌的 ssDNA ⽚段被细胞内的感受态特异的ssDNA结合蛋⽩相结合,并使ssDNA结合蛋⽩相结合,并且 使 ssDNA 进⼊细胞,随即在 RecA 蛋⽩的介导下与受体菌核染⾊体上的同源区段配对,重 组,形成⼀⼩段杂合 DNA 区段。
（3）受体菌染⾊体组进⾏复制,于是杂合区也跟着得到 复制。
（4）细胞分裂后,形成⼀个转化⼦和⼀个仍保持受体菌原来基因型的⼦代。
5、A-T 克隆的优缺点
优点：
（1）AT 克隆可以利用 Taq 酶在基因两端添加的单个脱氧核糖核苷酸 A 与线性载 体两端的单个脱氧核糖核苷酸 T 的互补配对完成快速的载体构建。
（2）AT 克隆可以将目的基因的插入位点放置在 LacZ’基因内部，从而利用蓝白斑筛选 快速完成阳性克隆筛选，可以避免载体自连带来的干扰。
缺点：
（1）AT 克隆不能规定目的基因在载体上的插入方向。
（2）AT 克隆不能避免载 体自连。
6、定向克隆的优缺点
优点：
（1）可避免载体和基因的自身环化。
（2）固定了基因在载体上的插入方向。
缺点：
（1）酶切位点不易找到。
（2）多体系完成（酶切载体、酶切目的基因、连接切 好的载体和基因）。
（3）酶切产物需要纯化才能进行连接，增加了实验的复杂性（内 切酶只切割 DNA 磷酸二酯键，不纯化切下的 DNA 单链会粘附在粘性末端，从而降低杂 合 DNA 分子的数量）
7、单酶切/平末端酶切载体构建法的优缺点
优点：
（1）酶切位点易选泽
（2）平末端目的基因基本无需改造（单酶切需要改造，添 加酶切位点）。
（3）酶切后载体、基因无需纯化即可进行连接操作
缺点：
（1）目的基因、载体自身环化和线性化连接概率高
（2）连接效率低（酶和底物 随机碰撞概率低）
8、去磷酸化克隆法的优缺点
优点：
（1）排除了载体自连的可能性，提高了杂合重组率
（2）降低了基因线性聚合的 概率，平板上生长的含杂合质粒的转化子概率高（目的基因自连成环的不能复制）
缺点：
（1）去磷酸化不能固定基因插入方向，可能有反向插入
（2）增加了去磷酸化这 一步骤，可能降低成功率
（3）只能选择去磷酸化载体和基因中的一个（另一个需要保 留磷酸基团用于连接），通常选择去磷酸化载体，导致目的基因仍有环化可能性，降低 了连接效率。
9、无缝克隆的优缺点
优点：
（1）基因插入位点选择灵活，不受酶切位点限制。
（2）省略酶切、切胶、连接 过程，反应单体系完成，操作快捷。
（3）基因以固定方向插入载体。
（4）多片段连接 效率高。 缺点：通常需要商品化试剂盒，成本高。
10、物质的污染 衡量所提取 DNA 的纯度可用 OD260 与 OD280 的比值,OD260/OD280 对 DNA 而言其值 大约为 1.8，那么当 OD260/OD280 大于 1.9 则可能有（ RNA ）污染，当 OD260/ OD280 小于 1.6 时则有（ 蛋白质 ）污染，同理，对 RNA 而言 OD260/OD280 值 大约为 2.0，当 OD260/OD280 大于 2.1 则可能有（ 异硫氰酸胍 ）污染，当 OD260/ OD280 小于 1.9 时则有（ DNA ）污染。
8.(单选题，10 分) 关于双脱氧测序和 DNA 复制的异同，描述错误的是：
A.双脱氧测序和 DNA 复制用的都是 DNA 聚合酶
B.双脱氧测序和 DNA 复制都需要引物
C.双脱氧测序和 DNA 复制都必须有变性-退火-延伸三个步骤的多次循环
D.双脱氧测序和 DNA 复制的主要差异之一在前者的反应底物是 dNTP 和四种 ddNTP， 而后者只需要 dNTP
