颠覆性技术RT&Tag，可广泛取代传统RNA蛋白互作研究
RIP/Clip/MeRIP/ChRIP-seq等基于免疫沉淀的技术，是研究RNA与其它生物分子互作最常见的方法，这些方法一般是用特异抗体拉下与RBP（RNA结合蛋白）结合的RNA或者具有特定修饰的RNA或RNA:DNA杂合链，然后再将回收纯化后的样本进行建库和测序。尽管这些技术已经很成熟，但是过程相当的复杂和繁琐。
近期 Steve Henikoff 团队在Nature Methods上介绍了一种名为逆转录和标记 (RT&Tag)的方法，能够简单快速的研究RNA蛋白互作及RNA修饰，未来有望取代传统技术【1】。
RT&Tag的实验原理
逆转录和标记 (RT&Tag)的方法首先利用抗体将Oligo(dT)-Adapter-B复合物绑定到目的蛋白附近， 然后偶联了Adapter-A的pA-Tn5转座体结合到抗体上，加入逆转录酶后，Oligo(dT)-Adapter-B作为引物在RNA的3‘端逆转录产生 RNA/cDNA 杂合链，随后Tn5 转座酶识别RNA/cDNA杂合链，打断后插入Adapter-A用于下游PCR扩增（图1）。
图1：RT&Tag技术原理流程
RNA和RBP互作研究
在雄性果蝇S2细胞系中使用MSL2抗体进行了RT&Tag实验，文库片段大小分布主要从200 bp—1000 bp，没有核小体倍数模式。reads主要来自外显子（66%），有少量的内含子（16%）和基因间区（18%），大多落在基因的3’端，与Oligo(dT)引物从成熟转录本的poly-A尾启动一致。
和以发表的RIP-seq数据相比较，RT&Tag也能够在S2细胞中识别MLE和roX2之间的相互作用，只需10万个细胞，测试深度减少4倍（图2）。
图2：RNA结合蛋白MSL2-RT&Tag数据分析结果
染色质结合RNA研究
Polycomb结构域是染色质的大区域，具有抑制性组蛋白H3K27me3标记，现有的一些研究表明，RNA参与了该区域的建立和维持。
以H3K27me3抗体进行RT&Tag，鉴定出1342个差异富集的转录本，其中1178个是蛋白编码基因，GO功能分析与Polycomb通路相关，同时这些靶基因上有更高的H3K27me3-CUT&Tag信号。然后，评估了在10万、2.5万及5千个细胞中RT&Tag均能成功富集到H3K27me修饰的靶基因。
图3：H3K27me3-RT&Tag数据分析结果
m6A修饰研究
研究者还发现 RT&Tag 可以检测 m6A 修饰的 mRNA，鉴定出了281个m6A富集的转录本和106个该修饰缺失的转录本，其中m6A富集的转录本GO功能富集在发育和转录因子结合通路。同样也评估了在10万、2.5万及5千个细胞中RT&Tag均能成功富集到m6A修饰的靶基因。
图4：m6A-RT&Tag数据分析结果
RT&Tag技术相较于传统免疫沉淀方法有很多优势，如只需要10万个细胞；测序深度4-8百万reads；可以应用于任何具有可用抗体的研究；直接打断RNA/DNA杂合链，不需要纯化核酸等。
原位抗体连接和标记使得RT&Tag可以满足染色质结合RNA、RBP-RNA相互作用及m6A修饰RNA的高通量分析的需要，特别是当样本输入受到限制时，如临床样本或胚胎细胞，提供了一个更加全能和更好的的研究工具。
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文献引用：
1.Khyzha, Nadiya, Steven Henikoff, and Kami Ahmad. "Profiling RNA at chromatin targets in situ by antibody-targeted tagmentation." Nature Methods (2022): 1-10.
