荧光定量PCR(qPCR)科研技术服务

一、实验原理

QPCR（Quantitative PCR，定量PCR）是一种利用PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）技术来定量检测DNA样品中某个特定基因的表达量的方法。它是PCR技术的一种应用，通过放大DNA片段并测定荧光素信号的强度，可以准确地计算出目标基因的表达量。相比于传统的PCR技术，QPCR可以检测到更低浓度的DNA，并且具有更高的准确性和可重复性。

二、应用领域

QPCR广泛应用于生命科学领域，特别是基因表达调控和疾病诊断等方面。通过QPCR可以快速、准确地检测基因表达的变化，进一步了解基因在生物体内的功能和作用机制。

(1) 基因表达调控研究：QPCR可以用来定量检测不同条件下基因的表达量，进一步研究基因表达的调控机制。例如，可以使用QPCR来研究生物体在不同发育阶段、不同环境适应或不同疾病状态下基因表达的变化。

(2)疾病诊断：QPCR可以用来检测人类或动物体内的病原微生物或疾病相关基因的表达量，如检测病毒、细菌、真菌等的感染情况，以及检测癌症相关基因的表达量，用于辅助疾病的诊断和治疗。

(3)药物筛选：QPCR可以用于筛选药物对特定基因的影响。通过检测药物对基因表达的调控效应，可以寻找新的治疗靶点或评估已有药物的疗效。

(4)食品安全监测：QPCR可以用来检测食品中的致病微生物或基因改造成分等。例如，可以使用QPCR来检测食品中的大肠杆菌、沙门氏菌、转基因成分等，以保证食品的安全性。

三、实验流程

QPCR是一种快速、准确、可重复的技术，可以用来检测基因表达的变化，广泛应用于基因表达调控的研究中。

1. RNA提取和反转录：首先需要从细胞或组织样品中提取总RNA，使用反转录酶将RNA转录成cDNA。RNA提取和反转录过程需要注意样品的质量和纯度，以保证实验结果的可靠性。

2.引物设计：选择合适的引物是QPCR实验的重要步骤。引物应当与目标基因序列特异性结合，并且能够在PCR反应中扩增出可靠的产物。通常需要设计两对引物，一对用于扩增目标基因，另一对用于扩增内部参照基因。

3.制备PCR反应体系：将cDNA、引物、荧光素和Taq聚合酶混合在一起。荧光素可以是SYBR Green或特定的探针。反应体系需要注意物质的比例和质量，以保证PCR反应的准确性和可重复性。

4. PCR反应：将反应体系加入PCR仪中进行PCR反应。PCR反应的温度和时间需要根据引物的特性进行优化，以保证PCR反应能够扩增出特异性产物。通常需要进行多轮PCR反应，检测荧光素信号的强度，确定PCR反应曲线和Ct值（Cycle threshold，PCR反应的临界周期数）。

5. 数据分析：通过计算目标基因和参考基因的Ct值差异，得出目标基因的表达量相对于参考基因的表达量的比值。通常使用2^-ΔΔCt法来计算相对表达量，其中ΔΔCt = (Ct目标基因 - Ct参考基因)实验组 - (Ct目标基因 - Ct参考基因)对照组，实验组和对照组是两组不同的实验样品。

四、样品的基本要求

6. 样品纯度：样品需要具有高纯度，避免污染和干扰。RNA样品需要避免DNA、蛋白质、RNA酶和有机物等污染物的存在，DNA样品需要避免RNA和蛋白质等污染物的存在。可以使用分子生物学方法如吸光比、琼脂糖凝胶电泳等方法检测样品纯度。

7. 品浓度：样品浓度应该适中，一般在20~200 ng/μl之间，避免样品浓度过高或过低导致PCR反应效果不佳。

8. 样品完整性：样品需要完整，避免分解、降解或受到其他因素损伤。RNA样品需要避免长时间储存、高温等因素的影响，DNA样品需要避免受到紫外线、酶等的损伤。

9.样品来源：样品的来源需要清楚明确，避免使用含有其他生物体的杂交样品或者污染样品。

实验数据提供：

提供详细的实验报告（包括详细的试剂、仪器、实验条件、操作步骤等）、定量数值结果及图形结果。

我们提供的均为客观的原始数据，不对这些数据的意义做统计分析；如您有统计方面的要求，请在签署合同时知会我们。

以下是一些关于定量PCR的文献：

Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-408. doi:10.1006/meth.2001.1262

Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/Technology. 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026

这些文献涵盖了定量PCR的一些基本概念、实验设计、数据分析以及常见的问题和挑战。如果您对定量PCR有特定的研究兴趣，可以在PubMed或其他科学文献数据库中搜索相关文献。