细胞培养（1）-细胞复苏

不同之处欢迎讨论。

1.准备工作：

实验开始前，将无菌培养瓶，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。（这个根据自己实验室情况来，懂的都懂哈哈哈。）

水浴箱调节至 37 度恒温。取细胞完全培养基。

消毒双手和超净台。取约 10ml 细胞完全培养基放于 15m 离心管中。

实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。然后迅速将冻存管投入到已经预热到37 度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在 1 min以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约 1min 后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。

2.以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，上下吹打 5 次,使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中 DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。

关于DMSO：细胞冻存液应按照无血清培养基、血清、DMSO 的比例为 7:2:1 配置（这个也是根据恁实验室的传统来。），其中加大冻存液中血清的比例对于保存某些脆弱的干细胞以及一些比较珍贵的细胞很有好处。冻存液应该提前配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞。后续的换液中会逐渐出去，非特殊情况一般解冻后不需要特意除去。

配平离心:采用天平配平两端，500rpm，室温离心5min（有需要的这步后可计数。）

3.离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入 1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。后将细胞悬液加入培养皿中，继续加入9ml细胞完全培养基，盖上皿盖摇匀，12h左右显微镜观察细胞状态，换液。

注意事项：

细胞复苏过程中需要注意以下细节：

1. 取冻存管要做好保护措施，防止细胞冻存管漏入液氮，导致爆炸。

2. 解冻速度要快，在常温下，冻存液中的 DMSO 对细胞的毒副作用较大，因此必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。

3. 细胞贴壁少时，一般冻存细胞解冻时 1ml 细胞液要加 10ml－15ml 培养基，培养基加入过多会造成细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

4. 一次复苏细胞不宜过多，细胞在解冻时，水浴锅内冻存管太多容易导致传热不佳，使融化时间延长。

5. 正规来说，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。