illumina测序原理
Flowcell 流动池
外观为小型芯片，有8条通道
通道内表面用共价键连接了2种DNA引物，这2种DNA引物与Library的接头序列互补
共价键保护引物在测序时不被液体冲洗掉
Library 文库
Library 是在许多个DNA片段的两头接上特定DNA接头形成的混合物接头是人为连接上的，且接头序列已知
Library 制作过程：用超声波打断基因组DNA - 用酶补平两头 - 用Klenow酶在3'段加上一个A碱基 - 用连接酶连上接头 - 得到一个Library
桥式PCR
桥式PCR是把Library种到芯片上进行扩增的过程，目的是使后续有足够强度的荧光识别信号
1.首先把Library加到芯片上，Library两端的接头与芯片上的引物互补，因此会产生互补杂交
2.杂交后，加入dNTP和聚合酶，会合成一条全新的DNA链
3.加入NaOH碱溶液，DNA双链被解开
模板链由于无共价键连接会丢失，互补链则被保留
4.加入中性液体，互补链的另一端会与芯片上的引物再次发生互补杂交，形成桥状
5.加入酶和dNTP，聚合酶沿着引物合成出一条新链
6.重复以上操作：①加碱，解链；②加中和液，杂交；③加酶、dNTP。
最终实现DNA链的数量以指数增长
7.后续操作：切除反向链上的一个特定基团，加入碱溶液，解链后反向链则会被冲走，只留下共价键连接的正向链
同时为了防止特异性结合重新形成单链桥，3’段被封锁
测序
1.加入dNTP（带荧光标记，且3’末端被一个叠氮基堵住，导致不能继续延长）与聚合酶，每次合成只延长一个碱基
2.用水冲洗掉多余的反应物，进行显微镜激光扫描
由于四种碱基所带荧光颜色不同，根据发出的荧光即可判断新合成的碱基，进而根据互补原理推出模板上对应位置的碱基
3.加入化学试剂，切掉叠氮基和荧光基团，暴露3‘端，从而使其可以连接下一个碱基
4.重复上述步骤
读取 Index / Barcode 条形码
由于仪器的测序能力一般远大于样本序列量，为避免浪费，常同时测定多个样品。为了区分不同样品的序列，就要事先在样品中加上特定的标记。
这个标记就是Index，它是在Library接头中的一段特定序列，标记了序列的来源。
流程：把read1解链后冲掉 - 加入read2引物 - 开始第二轮测序
