USP21与转录因子GATA3结合调节MAPK1表达影响胃癌进展与干细胞自我更新

写在前面

        今天推荐的是由浙江大学医学院在2021年3月15日发表于Frontiers in Cell and Developmental Biology（2020IF：6.6840，JCRQ1/Q2）的一篇文章，通讯作者是Dan Wu教授，研究表明去泛素化酶USP21通过与转录因子GATA3结合来调节MAPK1表达以调节胃癌的肿瘤生长和细胞干细胞。

研究背景

        胃癌（GC）作为消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，在许多亚洲国家仍然是十大癌症相关死亡病例之一。USP21是一种参与多种癌症恶性进展的去泛素化酶，其在胃癌中的作用及具体分子机制尚不清楚。

摘要部分

        本研究探讨了USP21在体外和体内的功能，并探讨了USP21在体外GC中的调控机制。作者报道USP21在体外促进GC细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞，并在体内调节小鼠的GC肿瘤生长和细胞干性。USP21通过与GATA3结合来稳定GATA3的表达。此外，GATA3还在转录水平调节MAPK1的表达。一系列体外实验证明USP21通过与转录因子GATA3结合来调节MAPK1的表达，从而调节GC的肿瘤生长和细胞干性。总的来说，这项研究确定了一个新的USP21/GATA3/MAPK1轴，它在促进GC的恶性进展中起关键作用，并可能为治疗提供潜在的靶点。

研究内容

1.USP21在GC组织和细胞中高度表达

        作者使用TCGA-STAD数据集分析USP21在GC患者中的表达。与正常组织相比，USP21在GC组织中显着高表达。作者进行qRT-PCR以评估USP21在临床GC组织和来自22名GC患者的邻近正常组织中的mRNA表达。结果显示USP21在GC组织中的表达明显高于邻近正常组织。与正常胃粘膜上皮细胞系相比，MGC-803显着增加了USP21 mRNA，说明了GC的肿瘤分级与USP21表达呈正相关的IHC结果。

研究结论：USP21可能在GC的恶性进展中发挥调节作用。

2.USP21促进GC细胞的增殖、迁移、侵袭和干细胞     

        由于USP21在GC中的异常表达，选择在分别具有相对低和高USP21表达的AGS和MKN-45细胞系进行研究。作者通过USP21靶向质粒转染AGS细胞进行过表达，而USP21 siRNA转染MKN-45细胞进行基因沉默。然后，通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测显示，转染oe-USP21的AGS细胞中USP21的表达显着增加，而转染si-USP21的MKN-45细胞中USP21的表达显着降低。为了检测USP21对细胞增殖的影响，进行了MTT和集落形成试验。结果表明，USP21的过表达显着提高了AGS细胞的生存力和集落形成能力，而抑制USP21的表达则显着降低了MKN-45细胞的生存力和集落形成能力。随后，通过Transwell试验评估USP21在细胞迁移和侵袭中的作用，USP21的过表达加速了AGS细胞的迁移和侵袭，而敲除USP21则显着降低了AGS细胞的迁移和侵袭。MKN-45细胞。进行蛋白质印迹以通过检测几种EMT标记蛋白E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和纤连蛋白的表达来测试USP21是否调节上皮-间质转化(EMT)。观察到AGS细胞oe-USP21组中E-cadherin和a-catenin显着减少，而N-cadherin和纤连蛋白显着增加。相反的结果出现在si-USP21组的MKN-45细胞中。

        众所周知，在非贴壁无血清培养基中生长时，CSCs可以完成自我更新，然后形成球体。为了进一步确定USP21在CSC生长和维持中的作用，研究了用oe-USP21处理的AGS细胞或用si-USP21处理的MKN-45细胞的球形成能力。用oe-USP21处理的AGS细胞的球形成能力显着提高，而用si-USP21处理的MKN-45细胞的球形成能力受到抑制。

 研究结论：USP21刺激了GC细胞的细胞增殖、迁移、侵袭和干性。

3.USP21可以在体外与GATA3相互作用     

        先前的研究证明USP21可能参与癌症的进展。然而，关于USP21在GC中的作用是否与GATA3相关的报道很少。在这里，通过TCGASTAD中的基因表达数据发现GATA3在GC中高度表达。进行免疫沉淀以研究USP21是否与GATA3相互作用。将含有Flag-GATA3和Myc-USP21的表达载体共转染到HEK293T细胞中，结果发现USP21和Flag-GATA3共免疫沉淀。

研究结论：USP21和GATA3可以直接相互作用。

4.MAPK1是GATA3的转录靶标

        作者在hTFtarget数据库上预测GATA3下游调控基因，并进行KEGG富集分析，发现预测的靶基因主要富集于MAPK信号通路。进一步提取富含MAPK信号通路的基因并进行PPI分析。同时，统计了PPI网络中每个基因的核心价值。发现MAPK1基因具有最高的核心值，表明MAPK1可能发挥了最重要的作用。在进一步搜索TCGA-STAD数据集中MAPK1的表达后，发现MAPK1在GC组织中高表达。综上所述，推测MAPK1可能是GATA3的下游目标。为了验证上述预测，构建了GATA3过表达质粒oe-GATA3和GATA3 siRNA（si-GATA3），分别转染AGS细胞和MKN-45细胞。qRT-PCR和蛋白质印迹表明GATA3的过表达显着增加了MAPK1的表达，而GATA3的敲低显着降低了MAPK1的表达。鉴于GATA3作为转录因子，GATA3和MAPK1在GC组织中均高度表达，推测GATA3可能直接促进MAPK1转录。为了验证这一假设，第一步是生成一个包含GATA3结合位点的MAPK1启动子，并使用定点诱变技术建立MAPK1突变。双荧光素酶检测结果表明，GATA3的升高显着增加了AGS细胞中MAPK1启动子的活性，而沉默的GATA3降低了MKN-45细胞中的启动子活性，对两者中MAPK1启动子的突变均无显着影响。进一步进行ChIP测定以确定GATA3和MAPK1启动子之间的直接相互作用。可以看出转录因子GATA3可以与MAPK1启动子相互作用以刺激MAPK1在GC细胞中的表达。

 研究结论：MAPK1是GATA3的转录靶标。

5.USP21通过GATA3调控MAPK1的表达并影响细胞增殖、迁移、侵袭和GC的干性

        作者进一步验证了USP21是否能通过GATA3/MAPK1轴发挥其对GC的致癌作用。通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析各组细胞中USP21、GATA3和MAPK1的mRNA和蛋白表达。结果表明，MAPK1的表达随着MAPK1的敲低而显着降低，而USP21和GATA3的表达没有明显变化。同时敲低MAPK1和过表达USP21可以显着增加GATA3和MAPK1的表达，表明USP21可以通过GATA3调节MAPK1。测定各组细胞增殖，发现si-MAPK1可以抑制AGS细胞和MKN-45细胞的增殖，同时敲低MAPK1和过表达USP21可以逆转si-MAPK1对细胞增殖的抑制作用。进行Transwell和蛋白质印迹以评估AGS细胞和MKN-45细胞中EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、a-catenin和纤连蛋白，从而研究各组的细胞迁移和侵袭。敲低MAPK1后，细胞的迁移和侵袭能力明显下降，细胞内E-cadherin和a-catenin显着增加，N-cadherin和纤连蛋白显着下降，而USP21的过表达部分抑制了这些作用。此外，发现si-MAPK1显着抑制AGS细胞和MKN-45细胞的球形成能力，但同时转染si-MAPK1和oe-USP21显着提高细胞的球形成能力。

研究结论：USP21通过GATA3调节MAPK1的表达，进而影响GC细胞的增殖、迁移、侵袭和干细胞。

6.USP21与体内GC的肿瘤生长和细胞干性相关

        建立小鼠异种移植模型以进一步分析USP21对体内肿瘤生长的影响。将过表达USP21的AGS细胞皮下注射到裸鼠体内，然后检测USP21在体内的致瘤作用。与阴性对照组相比，USP21过表达组的肿瘤重量和体积显着增加。此外， USP21的过表达显着增加了CSC球体的比例。通过qRT-PCR评估CSC标志物CD44和CD133在小鼠GC组织中的表达。结果显示USP21的过表达显着提高了GC组织中CD44和CD133的表达水平，表明USP21的过表达增强了GC细胞的干性。还发现在oe-USP21组的肿瘤组织中，USP21、GATA3和MAPK1均显着高表达。通过H&E染色和IHC评估裸鼠的细胞增殖，发现oe-USP21组的肿瘤中Ki-67阳性细胞明显多于对照组，而且肿瘤分级与Ki-67阳性细胞的数量以及USP21的含量呈正相关。

研究结论：USP21在体内调节GC的肿瘤生长和细胞干性。

结论与讨论

        该研究阐明了USP21作为癌基因促进了GC的细胞增殖、迁移、侵袭和干性。在这项研究中突出的是USP21的这种致癌作用是通过GATA3/MAPK1轴介导。总之，本研究首次确立了USP21/GATA3/MAPK1轴在GC中的作用，为GC的病理功能提供了新的机制，对开发新的靶向治疗具有潜在意义。

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原文链接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.641981/full