在细胞治疗的质量控制中， Bionano全基因组光学图谱技术（OGM）与测序强强联手！

为了扩大诱导多能干细胞 (iPSC) 的再生医学的前景，人类白细胞抗原 (HLA) 基因的精确和有效的基因组编辑将有利于最大限度地减少由 HLA 类型错配引起的免疫排斥。然而，人类 iPSC 系中多个 HLA 基因 的临床级基因组编辑仍未探索。在这里，我们优化了与 GMP级别CRISPRCas9 基因组编辑，以同时编辑 HLA 纯合 iPSC 中的三个基因位点 （HLA-A、HLA-B 和 CIITA 基因）。在通过单个 gRNA 诱导双等位基因敲除方面，使用 HLA 纯合 iPSC 与杂合 iPSC 相比具有一个主要优势。 RNA-seq 和流式细胞术 分析证实了 HLA 的成功去除，并证实了谱系特异性分化为心肌细胞。 我们还证实，基因组编辑的 iPSC 的多能性由三个胚层分化成功维持。此外，通过全基因组测序、核型分析和光学基因组作图分析显示，在某些克隆中未检 测到明显的基因组异常，而在其他克隆中观察到意外的拷贝数丢失、染色体易位和复杂的基因组重排。我们的结果表明多维分析对于确保基因组编辑细胞的安全性和质量的重要性。多维分析对生产和评估流程将成为 iPSC 临床级基因组编辑的基础。

我们使用 4D-Nucleofector（Lonza电转仪 可联系优宁维获取产品资料） 将 Cas9 蛋白和两个 gRNA （ HLA-A24-ex2g1 和 CIITA-ex3g5 ） 电转化到 FfI14s04 克隆中。在干扰素 (IFN)-g 刺激 2 天后，通过 HLAA 或 B 抗体染色和流式细胞术 (FCM) 证实了大块细胞 群中 HLA-A 和 HLA-B 蛋白的敲除效率。结果显示，77.9% 的细胞表面HLA-A蛋白表达阴性，72.1%的细胞HLA-B蛋白表达阴性，提示实现了双等位基因敲除。

为了更详细地检查 HLA-A、HLA-B 和 CIITA 目标位点 的插入或删除 (indel) 效率，进行了目标位点克隆和测序。我们从 41 个分析的克隆 (73.1%) 中选择了 30 个 HLA-A 敲除 (KO) iPSC 的克隆。我们进一步对这些克隆进行 Sanger 测序、 核型分析、WGS、RNA 和蛋白质表达分析，并评估分化潜能。 图1C）。

如图所示：

PCR+Sanger: 19/30 indel mutations

WGS: 3/11 large deletions, 1.4Mbp;1 off-target（与成瘤相关）

核型： 7/30 translocations

OGM：随机选取了9个进行分析，4 个有易位

结论：基因编辑导致的unwanted effect 发生比例很高

我们通过测序和OGM 相结合，最终能更全面的检测到Car-T的细胞质量。

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