猴艾滋病动物模型【动物实验外包】
猴艾滋病动物模型【动物实验外包】
（一）自发性及转基因动物模型
嵌合的猴/人免疫缺陷病毒(simian/human immunodeficiency virus,SHIV)是将SIV的部分基因以HIV-1基因替代，构建成的嵌合病毒，以研究 HIV不同基因的功能以及病毒与宿主的相互作用。例如，将SIVmac239的 tat、rev、env 基因替换为 HIV-1Lai 的 tat、rev,vpu、env基因，静脉接种这种SHIV给恒河猴、食蟹猴。在接种后的1～2周内，可以从所有接种的动物血液中检出高滴度的嵌合病毒，2~4周内血清转阳，CD4/CD8比例倒置,CD4+细胞数下降并出现淋巴腺病。这些动物可用于研究对囊膜蛋白的免疫反应与变异病毒增殖的相互关系。当以SHIVSF33、SHIVSF162静脉接种恒河猴后发现，不同 HIV毒株来源的env基因对 SHIV的致病性有不同的影响；SHIVSF33可在动物身上诱发 SIVmac239 感染类似的病毒血症，外周血淋巴结中的病毒量为SHIVSF162感染动物的10~100倍，抗gp160抗体滴度也比 SHIVSF162感染的动物高，这一模型适于分析 env基因的作用和评价针对 env蛋白抗原的疫苗。
（二）诱发性动物模型
【造模机制】猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)与 HIV 的生物学特性及形态学特征相似，对T细胞均有特殊嗜性。SIV的细胞受体为CD4，SIVcpz 含有HIV-1 特有的基因 vpu，SIVsm 和SIVmac 含有 HIV-2的特有基因 vpx。在亲缘关系上SIVcpz 与 HIV-1 更接近，而SIVsm 和 SIVmac 与 HIV-2更接近。目前对 SIV的研究多集中在 SIVmac 和 SIVsm 上,因为这两种病毒能在多种猕猴属动物身上引发致死性免疫缺陷综合征，同时伴发CD4+淋巴细胞下降、机会性感染、病毒性脑膜脑病。这些都与人类 AIDS 类似，因此现常以这两株病毒感染动物作为人类 AIDS研究用的重要的动物模型。在恒河猴自然或实验感染SIV后能迅速发生 SAIDS。
【造模方法】SIV感染猕猴引起类似人类艾滋病的免疫缺陷综合征。目前，最了解模型有 SIVmac 和 SIVsm 感染恒河猴的两个模型系统。SIVmac 对恒河猴的感染大多为致死性持续性感染。病毒感染量与临床结果无关，但是猕猴的存活能力与其抗体应答强度呈正相关。其临床症状表现为腹泻、消瘦、外用血 T4 淋巴细胞减少和对有丝分裂原增生应答降低，机会性感染常见。
选健康成年恒河猴，实验前经体检及血清检查证实无SIV,SRV和 STLV-1 感染。仪器药品：酶标仪、流式细胞仪、毒株 SIVmac251、RPMI-1640等。模型制作：动物常规麻醉，毒株 SIVmac251 以 3MID(3个 100%猴感染剂量)经静脉注射感染动物。感染后2周血浆病毒分离阳性，证明造模成功。
模型检测：
1.病毒分离 CEMx174 系人CD4+T淋巴细胞系。为一适用于SIV的亚克隆人T淋巴细胞系，生长于完全 RPMI-1640中。取猴静脉肝素抗凝血，离心2000r/min,30分钟，吸取血浆200μ1，以50倍做系列稀释，各相当于血浆SIVmac251滴度为 5,25,125,625,3125和15625 TCID/ml(tissue culture infective does），加入'24孔细胞培养板中，每孔用完全RPMI-1640培养液补至1ml，再加入2×10°/ml CEMx174 细胞悬液0.5m1，在37℃、5%CO条件下培养4周。定期观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)，以出现CPE判断为阳性记录相应稀释滴度。
2.血浆SIV p27抗原水平测定 ELISA法：SIV-1 p27 Antigen ELISA Kit 试剂盒,操作程序按试剂盒说明书，在15分钟内上酶标仪，在450nm下读取OD值，结果以 pg/ml 表示。
3.血清抗体滴度的测定 间接免疫荧光法（IFA）：感染猴血清经56℃、30分钟灭活后,，从1：10开始做2倍的系列稀释。滴加于SIVmac 感染 CEMx174 细胞抗原片病毒细胞孔上，同时设阳性及阴性血清对照，将玻片置37℃水浴箱湿盒中孵育40分钟,用 0.1mol/L PBS洗片3次，每次8分钟。甩干玻片，加抗猴 IgG荧光素结合物。37℃孵育40分钟，用6.1mol/L PBS洗片3次，每次2分钟，甩干。以50%甘油封片，置荧光显微镜检测结果。
4.猴外周血CD4+细胞计数 流式细胞仪法:取肝素抗凝血 2ml，收集外周单个核细胞于1.5ml Eppendorf管内，用尽量少的液体将细胞悬起，加入鼠抗人CD4单抗,4℃孵育 30分钟。1%FCS-PBS洗细胞3次，以少许液体重悬细胞，加入羊抗鼠 IgG-FITC 二抗,4℃避光孵育30分钟，洗细胞3次，加入2%多聚甲醛 1ml,4℃固定过夜。次日以 300 目尼龙过滤，上机检测，结果以占 PBMC中的百分率表示。
5.细胞培养和刺激 将分离所得外周血单个核细胞(PBMCs)用完全 RBMI-1640培养液调整至细胞浓度为1×10*/ml，移入24孔培养板中，每孔1ml，根据实验要求在各孔中分别加入终浓度为5μg/ml的ConA刺激液，另设不刺激对照，用完全 RBMI 1640培养液将孔内液体补至1.5ml,将细胞置于37℃、5%CO，培养箱中培养刺激 72 小时。
6.细胞周期分析将培养至72小时的细胞移入离心管中，1000r/min 离心10分钟。将上清移入0.5ml的小离心管，分装冻存于-70℃保存，留待检测 IL-2水平使用。细胞经1%FCS-PBS洗3次,用2%多聚甲醛磷酸缓冲液于4℃固定,过夜。次日,1%FCS-PBS 洗细胞2次，用碘化丙啶染液1ml重悬细胞，室温孵育30分钟，300目尼龙网过滤，上流式细胞仪分析。结果以S期细胞百分比(S-phase fraction,SPF)和增殖指数(proliferous index,PI，即为S+G2+M期细胞百分比）表示。
【模型特点】感染动物2周时血浆病毒滴度达到最高（1：3125）,4 周时下降到最低（1：5），其后虽有波动但维持在低水平：同期的SIVp27抗原水平检测显示相同的规律。动物在感染4周后、血清中检测到针对 SIVmac的抗体，且抗体水平随着时间的推移逐渐升高。感染后2周明显下降、到4周时开始逐渐恢复。正常细胞在经历 Con A 72 小时刺激后,SPF和PI分别从4.5%和11.8%上升到49.9%和65.4%,说明正常细胞在这一刺激条件下，有半数以上的细胞由 G0/G1期进入S期,（SPF达到了65.5%），表明有大量T淋巴细胞被活化。到感染第3周时，在同样刺激条件下，进入S期的细胞明显减少，SPF仅为9.8%，表现出明显的无反应状态（anergy)，而且直到感染4周时，这种状态仍未恢复。未感染的正常淋巴细胞对Con A刺激具有高水平表达L-2的特点（从刺激前的4.5pg/ml上升到88.66pg/ml）。SIV感染后2周和4周,IL-2表达水平在同样刺激下并无显著增加，说明感染抑制了IL-2的产生和分泌。
感染最初大部分动物有明显的病毒血症（viremia），表现为发热、皮疹、腹泻和外周浅表淋巴结肿大等类似于人感染的临床症状。此时病毒在体内大量复制，随后感染猴体内会出现强烈的细胞和体液免疫应答，血浆内病毒水平开始下降，并伴有高水平的循环抗体出现，动物一般能存活1～3年。在潜伏期，外周血CD4+T细胞持续减少，CD4+/CD8+比值下降。至感染后期，猴外周血中CD4+细胞逐渐下降，血浆病毒水平回升，并伴有体重下降、全身衰竭和机会感染（主要表现为顽固的腹泻和肺炎）。最常见的并发症为腹泻，有间歇性或偶发性，易导致体重下降。约有20%～30%的感染猴因缺乏有效的免疫应答而于数日内死亡。大多数感染动物的直接死因是严重腹泻，用抗生素和支持疗法均无效。动物在病死前伴有体重下降，精神、食欲欠佳，不进食，衰竭而死。另外，恒河猴感染 SIVsm的实验证明，尽管该病毒不引起其原有宿主的明显疾病，但会引起另一种宿主与人类艾滋病相似的免疫缺陷病。
【注意事项】
1.由于近来发现 SIV会感染违反规定进行操作的实验室工作人员，且出现血清转阳，所以在从事 SIV有关的动物模型研究时必须严格按照操作规程操作。
2.因SIV与HIV在抗原结构上的显著差异，使该模型不能直接用来评价人类艾滋病疫苗的有效性。
【应用范围】SIV动物模型主要用于下列3方面的艾滋病研究：
1.深入了解灵长类动物慢病毒的自然史和演变，并收集携带 SIV的野生动物的种属及这些病毒精确的基因组成。
2.确定艾滋病的发病机制。
3.发展艾滋病的疫苗和制订治疗对策SIV感染猕猴比用 HIV感染黑猩猩更易获得疫苗方法的比较。
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