首先为大家简述一下何为EZ Trans Plus 细胞转染试剂（Ⅱ）

它作为新一代的转染试剂，其转染原理是带正电的聚合物与核酸分 子的带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后，与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过胞吞作用 进入细胞。

使用方法（24孔板为例）

1. 接种细胞

对于贴壁细胞，转染前 18-24 h 进行铺板（不含抗生素），使其在转染时的密度大约在 80%左右。对于悬浮细胞，转染当天，在配制 EZ Trans-DNA 复合物之前进行铺板，每 500 µL 生长培养基中加入 4~8×10 5cells。

【注】：培养液中的血清不影响转染效率。转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。

2. 准备 EZ Trans-DNA 复合物

（1）对于每孔细胞，将 1 μg 质粒 DNA 稀释到 40 μL 无血清的高糖 DMEM 培养基（或 OPTI-MEM I 培养基），混匀。

（2）对于每孔细胞，将 3 μL EZ Trans 转染试剂稀释到 40 μL 无血清的高糖 DMEM 培养基（或者 OPTI-MEMI 培养基），轻轻混匀。

【注】：无血清的高糖 DMEM 培养基是稀释液，不能使用含血清的培养基进行 DNA 和 EZ Trans 转染试剂的稀释。因为 EZ Trans-DNA 转染复合物的形成过程不能含有血清。

（3）将稀释好的 EZ Trans 转染试剂尽快全部加入到已稀释好的质粒 DNA 中，轻轻混匀。【注】：此混合的顺序不能反向进行。

（4）室温放置 10-15 min，以形成 EZ Trans-DNA 复合物。

3. 转染细胞

（1）将上述 80 μL EZ Trans-DNA 转染复合物均匀滴入到含细胞的培养皿中。轻轻晃动培养皿或轻微振荡，让 EZ Trans-DNA 复合物分散均匀。

（2）在 37℃，5% CO2培养箱培养 6-18 h，去除含 EZ Trans-DNA 复合物的培养液，更换新的培养液，继续培养至对转入基因表达分析。

【注】：筛选稳定转染细胞株，转染细胞 24 h 后，将细胞传代至新鲜的生长培养基中（将细胞稀释 10 倍

以上），在 37℃，5% CO2培养箱中孵育 24 h，加入筛选培养基。在有转染抗性基因相匹配的药物筛选条件下，约 1～2 周可筛选到耐药性克隆，在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。

注意事项

1. 本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域

2. 质粒质量：请务必使用高纯度无内毒素转染级质粒。通过 260 nm 光吸收测定 DNA 浓度，260nm / 280 nm

比值确定 DNA 纯度（比值应该在 1.8～2.0 的范围之内）。如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。

3. 细胞条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保细胞没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞

是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。建议使用李记生物的胎牛血清（货号：AC03L055）培养细胞。

4. 细胞培养液要求：EZ Trans 细胞转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释 DNA 和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。确保细胞培养液没有被细菌、真菌或支原体污染。转染时培养液中不添加抗生素。

5. 试剂用量的优化：DNA 浓度和转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，初次使用应优化 DNA 浓度和转染试剂量以得到最大的转染效率。使用者可尝试每 1 μg DNA 使用 1～4 μL 体积 EZ Trans 细胞转染试剂进行优化。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是 1:2~1:5。

附1：

常见问题：

Q1：李记有3款转染试剂，这3款有什么区别？和Li**对比效果如何？

A1：我司自行测试与收集客户反馈数据，得到类似结论：

　　效率方面：EZ Trans Plus＞Li**2000≈EZ Trans(高效)＞Li** 3000＞EZ Trans(低毒)

　　毒性方面：EZ Trans(低毒)≈Li**3000＜EZ Trans Plus＜EZ Trans(高效)≈Li**2000

Q2：我们传的细胞有抗生素，抗生素是绝对会影响转染效率吗？

A2：能不加尽量不加，理论上抗生素进不到细胞内，但是在转染试剂的作用下，细胞的通透性增加，抗生素可能进到细胞内，对实验结果完成影响。

Q3：protocol提到，要用Opti-MEM稀释质粒和转染试剂。不能用1640稀释么？另外质粒和转染试剂为什么要先稀释然后再混合？不能把转染试剂直接加到质粒溶液中混合，然后再加培养基稀释么？

A3：EZ Trans细胞转染液属于阳离子类型的转染试剂，它与DNA形成复合物需要一定的条件，在合适的浓度下，有利于阳离子包裹DNA形成良好形态的复合物进入细胞。

如果直接把两者直接混合，两者容易很快形成聚合物，聚集相态多样，有可能使DNA暴露在表面，不容易进入细胞，进而降低转染效率。所以EZ Trans和DNA的混合顺序也很重要。 

培养细胞大多会用到胎牛血清，血清成分复杂，没有人能说清成分及含量。细胞转染液成分比较明确，但是不能确定是会不会与胎牛血清的不知名成分结合，事实上这种现象在大多数转染试剂中都会造成不良影响，所以在形成EZ Trans-DNA复合物过程中要避免血清的影响。

Q4：protocol提到，“24-48小时内检测转染效率”指的是去除含复合物的培养液换成含血清的培养基之后的24-48h，还是指加入复合物后转染24-48h？

A4：所有时间都是从EZ Trans-DNA复合物与细胞接触开始算。

Q5：我就是问的体内直接转染小鼠。你们现有的protocol是体外实验的方法?

A5：体内直接转染目前最多的是腺病毒，慢病毒，腺相关病毒。转染试剂直接在体内用的报道我们目前没有听过。现有的做法是细胞在体外培养，转染筛选后再打入体内。