miRNA芯片技术发现细胞外囊泡，促进结直肠癌肝转移新机制
2022年1月 18 日，复旦大学附属肿瘤医院大肠癌中心李大卫教授与李心翔教授作为共同通讯作者，在Journal of Extracellular Vesicles (IF: 25.841)杂志发表了题为“的研究论文，报道了肿瘤衍生的细胞外囊泡(EVs)miRNA 与结直肠癌肝转移中的肿瘤微环境之间潜在的分子机制。复旦大学附属肿瘤医院大肠癌中心赵森林为第一作者。文章中miRNA芯片技术及分析服务由欧易生物完成。
研究背景
结直肠癌 (CRC) 在全球癌症相关死亡率方面排名第二，约 50% 的 CRC 死亡是由肝转移引起的，肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）之间的相互作用在结直肠癌肝转移（CRLM）中发挥着重要作用。在 CRLM 期间，癌细胞可以通过重塑 TME 来诱导转移前生态位的形成。据报道，活化的肝星状细胞 (α-HSC) 特征被发现是继发性或原发性肝癌中最常见的生物学过程，α-HSCs 可以从静止状态转分化为高度增殖和移动的肌成纤维细胞。此外，α-HSCs 可以通过重塑和沉积细胞外基质 (ECM) 来影响 CRC细胞的生长和侵袭。目前细胞外囊泡 (EVs) 以其脂质双层膜和携带许多生物分子的特点，通常被认为是参与 TME 中细胞间通讯的信使，并已被证明在几种癌症的进展中发挥重要作用。因此，探索 CRC 细胞和 HSCs 之间的相互作用，以及CRC衍生的EVs是否通过分泌富含miRNA的EVs调节HSCs以诱导肝转移机制尤为重要。
研究内容
本研究通过miRNA芯片技术对高度转移性CRC细胞分泌的细胞外囊泡RNA进行检测，发现高度转移性CRC细胞比表现出低转移潜能的细胞释放更多富含 miR-181a-5p 的细胞外囊泡促进了 CRLM。此外，该研究验证了 FUS 介导 miR-181a-5p 包装入 CRC EVs，从而通过靶向 SOCS3 和激活 IL6/STAT3 信号通路来激活肝星状细胞 (HSC)。活化的 HSC通过分泌趋化因子 CCL20，进一步激活 CCL20/CCR6/ERK1/2/Elk-1/miR-181a-5p 正反馈回路，导致 TME 重塑和 CRLM 中转移前微环境的形成。临床上，含有高表达miR-181a-5p 的血清 EVs 与 CRC 患者的肝转移呈正相关。总之，富含 miR-181a-5p 的高度转移性 CRC 细胞衍生的 EVs 可以激活 HSC 并重塑 TME，从而促进 CRC 患者的肝转移。这些结果为CRC肝转移的潜在机制提供了新的见解。
研究路线
研究结果
1、高转移性 CRC 细胞的 EVs 在 CRLM 期间激活 HSC
为了探究CRC 细胞是否可以通过 EVs 的活性激活肝星状细胞，该研究中选择了两个具有弱转移潜能的 CRC 细胞系和两个具有高度转移性的细胞系的 CRC 细胞衍生的 EVs。通过电子显微镜、纳米粒子追踪分析和WB进行EVs的鉴定，并发现高度转移的 CRC 细胞可以分泌出更多的 EVs（图 1a-c）。通过免疫荧光成像发现CRC 细胞释放的标记 EVs 被递送至 HSC（图 1d）。
为了研究CRC来源的EVs对HSC的影响，该研究通过 Transwell 分析，发现源自高转移性 CRC 细胞的 EVs 可以增强肝星状细胞在体外的侵袭能力（图 1e）。
在转移性肝癌的转移前生态位的形成过程中，慢性肝脏炎症是常见的，所以，作者又检测了CRC 衍生的 EVs 刺激后肝星状细胞中促炎基因的表达水平, 发现高转移性 CRC 细胞的 EVs 共培养的肝星状细胞表达的 IL-6、IL-8、COL1A1、COL3A1 和 COL4A1（尤其是 IL-6）的 mRNA 水平更高。此外，在小鼠中注射来自高转移性 CRC 细胞的EVs 后检测到更多的肝转移以及重塑了肝脏 ECM（图 1 g-j）。
图1 | 源自高度转移性 CRC 细胞的 EVs 介导 HSC 的激活
2、源自富含 miR-181a-5p 的高度转移性 CRC 细胞的 EVs 可激活 HSC
为了阐明 CRC 细胞衍生的 EVs miRNA 是否参与 HSC 激活，作者首先使用miRNA芯片比较了来自不同 CRC 细胞的 EVs 之间的差异表达miRNA（图 2a）。随后，作者又使用 TCGA 数据库进行表达和预后分析，最终选择了miR-181a-5p作为研究目标并进行表达量的验证（图 2b）。
通过EVs 分泌抑制剂 GW4869处理和荧光标记等实验，证明miR-181a-5p 通过 EVs 从 CRC 细胞转移到 HSC，并且高转移性 CRC 细胞转移了更多的 miR-181a-5p（图 2c-d）。
在肝星状细胞中过表达和抑制miR-181a-5p，可以促进或抑制肝星状细胞的侵袭能力以及IL-6和IL-8的表达（图 4e-f）。用miR-181a-5p模拟物或抑制剂转染高转移性 CRC 细胞，然后获得 EVs 并将其添加到肝星状细胞中，也可以发现同样的表型（图 2g-h）。
总之，这些结果表明CRC细胞衍生的EVs miR-181a-5p可以促进HSC的活化。
图2 | CRC细胞中富含miR-181a-5p的高度转移性EVs可调节HSC的活化
3、miR-181a-5p 转移到 EVs 受 FUS 调控
据报道，EVs 介导的 RNA 分泌需要特异性和选择性的 RNA 结合蛋白进行转运。通过分析 RNA 结合蛋白特异性数据库，作者通过RBPDB数据库预测了miR-181a-5p的潜在的RNA结合蛋白 （RBP），并通过敲降、pull-down以及RNA 免疫沉淀等实验证明了FUS 可以在 CRC 细胞中介导 miR-181a-5p 包装到 EVs 中，并将其转移到 HSC中（图 3）。
图3 | FUS 调节 miR-181a-5p 转移到高转移性 CRC 细胞的 EVs
4、 EVs中的 miR-181a-5p 通过靶向 SOCS3 激活HSCs中的IL6/STAT3 信号通路
为了进一步探索 CRC 细胞衍生的 EVs miR-181a-5p 在 CRLM 期间参与激活 HSCs 的机制，进行了 GO/KEGG 富集分析（表S7，S8）。通过数据库分析表明，miR-181a-5p 序列可以比对上细胞因子信号 3 抑制因子 (SOCS3) 序列的 3'-UTR（图 4a）。通过双荧光素酶实验、qPCR和WB实验证明了 SOCS3 是miR-181a-5p的靶基因（图 4b-d）。通过挽救实验证明了miRNA可以通过抑制靶基因来发挥促进侵袭和激活IL6/STAT3 信号通路的功能（图 4f-h）。同时，使用过表达或抑制miR-181a-5p的EVs处理靶细胞，也有相同的表型（图4e、4j-k）。
这些数据表明，EVs miR-181a-5p 通过激活 IL6/STAT3 信号通路靶向 SOCS3 直接激活 HSC。
图4 | 源自高转移性 CRC 细胞的富含miR-181a- 5 p 的 EVs 通过 IL6/STAT3 信号通路靶向 SOCS3 激活 HSC
5、由CRC 衍生的 EVs miR-181a-5p 激活的HSC 反过来促进 CRLM
通过体外 Transwell 测定，证明外源性 miR-181a-5p 可以显著促进 CRC 细胞的迁移和侵袭（图 5a-b）。此外，体外 Transwell 测定（图 5c-d）和体内肝转移小鼠模型（图 5e-g) 都表明，由 CRC 细胞衍生的 EVs miR-181a-5p 激活的 α-HSCs 反过来也促进了 CRC 细胞迁移、侵袭和转移性肿瘤集落在肝脏中的形成。随后，使用 WB 分析和 IHC 染色进一步检查了小鼠肝脏转移灶中 ECM 成分的表达，结果表明CRC细胞衍生的EVs miR-181a-5p通过增加α-SMA和纤连蛋白的表达，同时降低玻连蛋白和生腱蛋白C的表达，重塑了肝脏ECM（图 5h）。因此，这些表明 CRC 细胞衍生的 EVs miR-181a-5p 可以重塑 CRLM 期间的转移前生态位。
图5 | 由CRC 细胞衍生的富含miR-181a-5p的 EVs 激活的 HSC促进体外CRC细胞迁移和侵袭以及体内肝转移
6、活化的HSCs通过激活CRC中的CCL20/CCR6轴来促进结直肠癌肝转移
由于α-HSC可能分泌包括趋化因子在内的促炎信号来调节TME和癌症进展，所以研究者通过人类趋化因子筛选检测试剂盒，检测了与 RKO 细胞衍生的 EVs 或阴性对照预培养的肝星状细胞中的趋化因子水平，并通过定量和挽救实验验证了CCL20是受miR-181a-5p调节最明显的趋化因子（图 6a-c）。此外，CCL20的受体 CCR6 蛋白在CRC 组织中的表达也明显强于正常组织（图 6d），表明 LX2细胞分泌的CCL20可能对CRC细胞发挥作用。
为了进一步研究CCL20/CCR6轴在CRLM中的作用，用抗体中和和敲降两种方式来抑制CCL20/CCR6轴可以部分抵消α-HSC在体外和体内对CRC细胞迁移、侵袭和肝转移的增强作用（图6e-i）。以上结果表明，CRC细胞衍生的EVs miR-181a-5p可以激活HSC，而 α-HSC又通过激活CRC中的CCL20/CCR6轴来促进CRLM。
图6 | 活化的 HSC 通过 CCL20/CCR6 轴促进 CRC 肝转移
7、CCL20/CCR6/ERK1/2/Elk-1/miR-181a-5p正反馈回路在CRLM期间介导HSC和CRC细胞之间的相互作用
该研究发现过表达miRNA的肝星状细胞培养基处理肿瘤细胞是可以上调肿瘤细胞中的miRNA表达的，如果用CCL20的抗体中和处理HSC细胞后，这个现象会消失，就说明了α-HSCs可以通过CCL20来影响CRC细胞的功能，并且肿瘤细胞中的miR-181a-5p表达也会受到CCL20和ERK1/2 信号通路的正向调节（图 7a-b）。
由于ERK1/2 易位到细胞核并促进其靶基因的转录，因此作者通过敲降、荧光素酶报告和位点突变实验、挽救实验等一系列分子实验，证明了HSC通过分泌的CCL20来促进ERK1/2信号通路的激活，激活的ERK1/2信号通路进一步通过Elk-1促进了CRC中的miRNA表达，形成了一个正反馈调控回路（图 7c-j）。
图7 | CCL20/CCR6/ERK1/2/Elk-1/miR-181a-5p正反馈回路在CRLM期间介导HSC和CRC细胞之间的相互作用
8、miR-181a-5p 可作为 CRLM 的新型生物标志物
最后，为了进一步证实 CRLM 中 miR-181a-5p 表达的临床意义，作者对结直肠癌组织、患者血清外泌体中的miR-181a-5p表达进行了检测，发现III-IV期肿瘤中miR-181a-5p的表达显著高于I-II期的肿瘤组织（图8a），肝转移患者血清EVs中miR-181a-5p的表达水平高于无转移的患者（图8b）。此外，miR-181a-5p表达较高的CRLM患者也表现出更高的CEA和α-SMA表达（图 8e）。CRLM 患者肿瘤组织中miR-181a-5p高表达，预示着预后较差（图 8f-g )。综上所述，这些结果表明CRC衍生的EVs miR-181a-5p在CRC的进展中起着关键作用，尤其是在结直肠癌肝转移中。
图8 | EVs miR-181a-5p 可作为 CRC 肝转移患者的新型生物标志物
研究结论
1） 高度转移性 CRC 衍生的 EVs miR-181a-5p 通过调节 IL6/STAT3 信号通路激活 HSC；
2） 通过 ERK/Elk-1 通路上调 CRC 中 miR-181a-5p 的表达，在 CRC 细胞和 HSC 之间形成正反馈回路，使得TME 重编程，最终导致 CRLM中转移前小生境的形成。
参考文献：
Zhao, S., Mi, Y., Zheng, B., Wei, P., Gu, Y., Zhang, Z., Xu, Y., Cai, S., Li, X., & Li, D. (2022). Highly-metastatic colorectal cancer cell released miR-181a-5p-rich extracellular vesicles promote liver metastasis by activating hepatic stellate cells and remodeling the tumor microenvironment. Journal of Extracellular Vesicles, 11, e12186. https://doi.org/10.1002/jEVs2.12186\
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