文献阅读—CX3CR1高表达的巨噬细胞缓解VAT内ASC的衰老从而维持VAT适应代谢的能力

        今天要讲的这篇文献是2023年5月在cell reports上发表的一篇文章，名字是CX3CR1hi macrophages sustain metabolic adaptation by relieving adipose-derived stem cell senescence in visceral adipose tissue。

       我们都知道在短期营养过剩时，脂肪细胞可以通过增生或肥大完成适应性扩张，储存更多的甘油三酯。ASC是脂肪组织内的干细胞，可以支持脂肪组织的增生适应。如果ASC发生衰老，细胞周期被阻滞，一定会影响到ASC的增生能力，从而影响脂肪组织适应性扩张的能力。所以ASC在短期营养供应过剩时保持活性，是脂肪组织能够顺利适应性扩张的前提。但是ASC如何在营养过剩期间减少细胞衰老的机制还不清楚。这篇文章就提出了自己的猜想，他们认为这个过程与巨噬细胞有关。

       他们首先通过流式检测了脂肪组织内巨噬细胞的数量，发现相较于SAT，VAT内的巨噬细胞数量，不论是在SVF总体还是在免疫细胞中的占比都更高。因为无论是新生鼠还是老年鼠，它们VAT内Ki67的信号都不强，也就是说VAT中巨噬细胞是因为细胞增殖才增多的，而更有可能是因为VAT会分泌更多的巨噬细胞趋化因子。通过分析数据集发现相较于SAT，VAT中巨噬细胞趋化因子MCP-1 mRNA数量更高，并且分析发现在VAT中巨噬细胞数量与MCP-1的含量存在正比关系，他们自己的实验结果也显示出VAT-SVF内MCP-1和巨噬细胞数量都更多，并且存在正相关。也就是说VAT会分泌更多的MCP-1吸引巨噬细胞。更准确一点来说，是VAT内SVF部分的ASC会分泌更多的MCP-1。

        为了验证这种说法，他们进行了细胞迁移实验，将VAT-ASC培养在下方，24h后在上方加入巨噬细胞，6h后进行结晶紫染色。结果显示，相较于SAT-ASC，VAT-ASC对巨噬细胞的吸引作用更强，并且这种吸引作用在添加MCP-1抗体之后会减低。另外补充实验添加了MCP-1受体CCR2的阻断剂，结果也是同样的会减低ASC对巨噬细胞的吸引作用。

       但是ASC吸引巨噬细胞聚集到VAT的作用是什么呢？所以他们使用clophosome耗竭脂肪组织的巨噬细胞，观察在短期营养过剩时巨噬细胞的作用。他们的实验中短期高脂喂养选择的是3周，就像前面提到的在这个时长内脂肪组织还可以进行适应性扩张，还处于机体可以调节的范围内。结果显示，无论是正常喂食还是高脂喂食，在清除掉巨噬细胞之后，小鼠的体重都不能正常升高，VAT质量与体重的比值也相对较低，这说明巨噬细胞减少之后VAT的正常扩张受到了影响。另外在清除掉巨噬细胞之后，高脂喂养的小鼠出现了糖耐量降低。

       前面提到VAT的正常扩张与脂肪组织的衰老程度有关，所以他们对四组小鼠的VAT进行了βgal染色，结果显示清除掉巨噬细胞的小鼠VAT衰老更严重，并且脂肪细胞也出现异常肥大。他们检测了脂肪增生的相关基因，其中PPAR-γ还做了WB实验，结果都显示VAT内的巨噬细胞清除之后影响到了VAT内的脂肪生成。

        实验结果还显示，在清除掉巨噬细胞之后，VAT内ASC的衰老更严重，ASC的数量也下降。也就是说，在ASC分泌MCP-1吸引巨噬细胞的同时，巨噬细胞也会反过来抑制ASC的衰老。

       另外他们还发现，使用clophosome清除掉的巨噬细胞有很多是CX3CR1表型，而CX3CR1高表达巨噬细胞的数量与ASC的数量也是正相关的关系。这似乎说明巨噬细胞高表达CX3CR1与巨噬细胞抑制ASC衰老有关。

       为了验证这个猜想，他们构建了VAT-ASC和巨噬细胞共培养的模型，结果显示共培养处理后，共培养环境中的ASC衰老程度减低，共培养系统中的巨噬细胞高表达出了CCR2、CX3CR1、Arg1。CCR2前面说到了是MCP-1的受体。共培养促进巨噬细胞高表达CX3CR1，这个后面会提到，是ASC通过分泌外泌体实现的。在共培养环境中分别沉默巨噬细胞内的CX3CR1和Arg1，会发现ASC的衰老程度增加。另外他们发现，沉默CX3CR1会使Arg1 mRNA数量降低，而沉默Arg1却会使CX3CR1 mRNA数量升高，也就是说可以初步建立起一个上下游关系，CX3CR1会作用于Arg1从而对ASC发挥作用。

      在体内，精氨酸会在Arg1的作用下转化为鸟氨酸，鸟氨酸又会转化为腐胺和亚精胺，亚精胺会作用于eIF5A使eIF5A hypusination化，hypusination化的eIF5A会增强氧化磷酸化和细胞自噬。我们都知道如果细胞自噬增强的话细胞衰老是会在一定程度上缓解的。

       于是他们检测了ASC中这条轴上的相关蛋白，发现在巨噬细胞存在的时候，ASC中eIF5A hypusination化程度增强，细胞自噬增强，细胞衰老减轻。并且使用GC7抑制eIF5A hypusination化，或者沉默eIF5A基因，ASC的衰老程度增强。

       前面我们提到了ASC会通过外泌体使巨噬细胞CX3CR1表达增多，这些就是针对这个猜想的实验结果。结果显示，当巨噬细胞单独被ASC外泌体孵育时，巨噬细胞内CX3CR1和Arg1表达升高，高表达CX3CR1和Arg1的巨噬细胞数量增多。如果使用抑制外泌体生成的GW4869预处理ASC后再与巨噬细胞共培养，巨噬细胞内CX3CR1和eIF5A的表达不再升高，巨噬细胞对ASC衰老的抑制作用也减退。如果在ASC和巨噬细胞共培养环境中加入额外的外泌体，ASC的衰老程度更加下降。

        总而言之，在短期能量供应过剩时，ASC会分泌MCP-1吸引巨噬细胞聚集在VAT中，并且会分泌外泌体使巨噬细胞表现出CX3CR1高表达的表型。同时CX3CR1高表达的巨噬细胞又会通过Arg1-多胺-eIF5A hypusination轴减少ASC的衰老，从而保证脂肪组织的适应性扩张能力。但是如果高脂喂养时间延长，血液中的LPS含量会升高，它会攻击VAT-ASC，并且促进ASC释放TNF-α，他们认为TNF-α的存在会抑制巨噬细胞高表达CX3CR1，从而使短期能量供应时ASC和巨噬细胞的相互促进的循环崩溃。

        为了验证这个猜想，他们使用LPS预处理了VAT-ASC，再将巨噬细胞加入进行共培养，结果显示此时再共培养确实会抑制巨噬细胞表达CX3CR1、Arg1，巨噬细胞的存在也没有办法减轻ASC的衰老，并且ASC确实会分泌更多的TNF-α。所以他们在共培养环境中加入TNF-α的抗体，结果显示消除TNF-α的影响后，LPS对巨噬细胞表达CX3CR1和Arg1的抑制作用也同样消失，ASC的衰老程度也减轻。

       接着他们思考既然高脂喂养会使ASC和巨噬细胞之间的循环崩溃，那如果在长期高脂喂养时在机体内转移进CX3CR1高表达的巨噬细胞，能不能达到重建循环，减轻ASC的衰老。他们对小鼠进行了19周的高脂喂养，在喂养的最后3周将高表达CX3CR1的巨噬细胞在外泌体孵育后转移入小鼠体内。这些巨噬细胞加入了DiD标签，可以通过活体成像观察巨噬细胞在VAT内聚集的程度。结果显示转移的巨噬细胞更多的富集在VAT中，尽管肝脏上也有信号，但是它的强度相对于VAT内更弱，所以他们认为可忽略不计。尽管转移了CX3CR1高表达的巨噬细胞并不影响高脂喂养小鼠的体重，但是小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗有所缓解，脂肪细胞也没有过分肥大，脂肪组织内ASC的衰老水平下降，ASC的数量也增多。脂肪增生程度升高，细胞自噬增强。除此以外他们还发现，在转移了高表达CX3CR1巨噬细胞之后，脂肪组织内与褐色脂肪组织生成相关的基因表达增加，他们可以观测到小鼠的体温升高，能量消耗增多，氧气消耗和二氧化碳生成增多，换气比值升高。

       既然已经知道了转移高表达的CX3CR1巨噬细胞可以达到改善代谢的作用，那如果降低CX3CR1的表达程度会不会对改善作用有影响。所以他们分别从CX3CR1杂合的鼠和CX3CR1缺失纯合鼠体内分离出巨噬细胞，在外泌体孵育之后将这些巨噬细胞转移进长期高脂喂养的小鼠体内。结果显示它们的体重依旧没有太大变化，移入CX3CR1杂合巨噬细胞的小鼠葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗得到适当的缓解，ASC的衰老程度也适当减轻，但是缓解程度明显没有高表达CX3CR1巨噬细胞强，这可能就是因为杂合巨噬细胞内CX3CR1的表达程度有限。CX3CR1缺失纯合的巨噬细胞对于高脂喂养的小鼠则没有什么作用。另外他们发现CX3CR1杂合巨噬细胞的转移可以适当恢复脂肪组织内CX3CR1高表达巨噬细胞的数量，适当恢复ASC的数量。

        最后他们进行了额外实验去探索CX3CR1如何影响Arg1。首先知道Stat3的激活与Arg1的活性有关，所以他们检测了CX3CR1杂合和CX3CR1缺失纯合的巨噬细胞内的p-Stat3和Arg1的表达水平，结果显示CX3CR1确实通过激活Stat3作用于Arg1，他们还沉默了巨噬细胞内的CX3CR1也得到了同样的结果。因为CX3CR1是一种G蛋白耦联受体，所以他们使用EGTA和BAPTA阻断了钙离子的转移，结果发现Stat3的激活作用和Arg1的表达水平也跟着下降。也就是说CX3CR1通过转移钙离子激活Stat3和Arg1。荧光结果也是这样的。相对于CX3CR1缺失纯合的巨噬细胞，CX3CR1杂合巨噬细胞内表现出更密集的钙离子信号。沉默了巨噬细胞内的CX3CR1后细胞内的钙离子信号强度降低。使用外泌体增加CX3CR1表达后巨噬细胞内的钙离子信号又会增强。

        总而言之，在短期高脂喂养时，VAT内的ASC会释放MCP-1吸引巨噬细胞，并且通过释放外泌体使巨噬细胞表达出高水平的CX3CR1。巨噬细胞内的CX3CR1通过转移钙离子激活Stat3，从而激活Arg1，通过Arg1-多胺-eIF5A hypusination轴使ASC细胞自噬增强、细胞衰老缓解，从而维持脂肪组织的正常增生能力。而在长期高脂喂养时这个相互作用会被破坏。但是对高脂喂养的个体转移外源高表达CX3CR1巨噬细胞后这个相互作用又会得到恢复，并且机体脂肪组织表现出棕色化的趋势。