小鼠免疫后，细胞免疫水平检测指标（硕士博士毕业检测项目）

2.11 细胞免疫检测

2.11.1 脾细胞分离方法（实操版本）

在首次免疫后第14天及28天，每组随机选取5只小鼠，解剖后采集脾脏，准备进行小鼠脾脏淋巴细胞的分离。具体分离方法如下：

1) 脱颈处死小鼠后，将其浸泡在75%酒精溶液内静置10 min；

2) 在无菌操作台内解剖小鼠，分离脾脏，尽可能去除干净脾脏周围脂肪组织；

3) 在小鼠淋巴细胞分离液中顿性研磨脾脏，经70孔目细胞过滤器过滤后转移至15 mL离心管中。小心沿着管壁加入1 mL无血清RPMI-1640培养液，使其覆盖于分离液上层。水平离心机 2000 rpm/min 室温离心 30 min；

4) 离心后的液体共分为4层，小心吸取上面第二层的淋巴细胞至新的15 mL离心管中。加入 5 mL 红细胞裂解液，颠倒混匀后水平离心机1500 rpm/min室温离心10 min；

5) 弃掉上清液，加入10 mL无血清RPMI-1640培养液，水平离心机1500rpm/min室温离心10 min；

6) 重复步骤5一次；

7) 弃掉上清液后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬，计数后保存于含5% CO2的 37℃细胞培养箱中备用。

2.12 T淋巴细胞检测

1. 取上一步骤中分离的各组小鼠脾脏淋巴细胞通过流式细胞术检测各组细胞亚群数量，具体操作步骤如下：

2. 每只小鼠取1×106个脾脏淋巴细胞，3000 rpm/min室温离心5 min；

3. 轻轻弃掉上清，加入500 ul 1×PBS缓冲液重悬细胞团，3000 rpm/min室温离心5 min；

4. 轻轻弃掉上清，加入100 ul 1×PBS缓冲液重悬细胞团。按照流式抗体说明书建议浓度及用量分别加入荧光抗体PerCP-Cy5.5 anti-mouse CD3、FITCanti-mouse CD4 和 PE anti-mouse CD8并充分混匀，而后置于 4℃冰箱避光孵育30min；

5. 3000 rpm/min室温离心 5 min；

6. 在避光或弱光环境中，轻轻弃掉上清，加入500 ul 1 ×PBS缓冲液重悬细胞团，3000 rpm/min 室温离心5 min；

7. 重复步骤（5）一次；

8. 轻轻弃掉上清，加入500 ul 1×PBS 缓冲液重悬细胞团，随即转移至流式管中，待上机检测荧光信号；

9. 结果分析：利用Flowjo软件分析10000个细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+亚群数量，利用 GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析与制图。

备注：流式分析（107-5*107），尽可能多，24孔板（500ul)，灭活苗/5个孔（其中四个用于单染）。细胞刺激；若晚上分完细胞，可以明天一早刺激，刺激剂（PMA）加1ul，抑制剂（BFA）2ul用于流式分析的4-6h，收样染色。

2.13 酶联斑点免疫检测（ELISA-Spot）

第一天：接种细胞，加入刺激物，培养（严格注意无菌操作）

1) 预包被板的活化：每孔加入200ul无血清培养基或者RPIM-1640培养基，室温静置5-10min分钟后将其扣出。

2) 加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各试验孔，100ul/well。正对照孔：细胞浓度可采用1×105 cells/well；负对照孔：细胞浓度可采用1×105 cells/well；背景负对照：加入重悬细胞所用的培养基；实验孔：样品的细胞浓度由实验者根据实验自行调整。

3) 加入刺激物：10ul/well，具体如下：正对照孔加入阳性刺激剂工作液。负对照孔（含背景负对照孔）：加入重悬细胞所用的培养基；实验孔：加入实验者自己的刺激物（用无血清培养基或者RPMI1640配制成10×终浓度）。

4) 孵育：所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37℃。5% CO2培养箱培养16-24小时。

第二天：培养后操作（不在需要无菌操作）

1. 裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加入冰冷的去离子水。200ul/well，4℃冰箱放置10分钟低渗裂解细胞。

2. 洗板：甩出孔内液体，加入1×Washing buffer，260ul/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复六次，每一次在吸水纸上扣干。

3. 检测抗体孵育：将稀释好的生物素标记的抗体（Biotinylated antibody）工作液加入实验孔，100ul/well。37℃孵育1小时。

4. 洗板：重复步骤2。

5. 酶联亲和素孵育：将稀释好的酶标亲和素（Streptavidin-HRP）工作液加入各实验孔，100ul/well。37℃孵育1小时。

6. 洗板：甩出孔内液体，加入1×Washing buffer，260ul/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复五次，每一次在吸水纸上扣干，然后揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤膜底面及底座，用吸水纸小心吸干底座及膜残留的水迹，合上底座，加入1×Washing buffer，260ul/well，停留1分钟后弃去孔内液体，彻底扣干孔内液体。

7. 显色：将现配的AEC显色液加入各实验孔，100ul/well。室温避光静置5-30分钟，根据斑点生成情况选择终止显色时间。若室温低于20℃，建议在37℃孵箱做显色，每隔5-10分钟检查一次。

8. 终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤正反面及底座3-5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待自然晾干后合上底座。

9. ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

10. 若不能及时读板时，请将板条避光密封保存，尽量在一周内读板。

2.14 淋巴细胞增殖试验（CCK-8法）

1. 用1640完全培养基重悬分离的脾淋巴细胞，进行细胞计数，使细胞浓度为2×106cells/ml；

2. 用1640完全培养基重悬分离的脾淋巴细胞，进行细胞计数，使用细胞浓度为2×106cells/ml；

3. 每个样品设置3个组别，即多肽刺激组，ConA刺激组和未刺激组，将上述淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板中（50ul/孔），分别加入50ul相应的刺激物，多肽刺激组加入等量混合的肽，每种肽浓度为5ug/ml，ConA刺激组加入5ug/ml ConA的完全培养基。未刺激组加入50ul 1640完全培养基。于37℃，5% CO2培养箱孵育72h；

4. 待孵育完成后，每孔加入10ul CCK-8溶液，37℃避光放置3h，450nm波长下检测OD值；

5. 按照下面公式计算刺激指数SI=(OD样品孔-OD空白孔）/(OD阴性孔-OD空白孔）或者刺激指数（SI）计算公式如下（刺激物刺激孔OD值-空白孔OD值）/未刺激对照孔OD值。

注意：96孔板最外侧一圈加PBS，蒸发对结果有影响。

2.15 血清细胞因子检测（上海欣博盛公司试剂盒）

1. 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4 C。

2. 空白孔加标准品和标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100 ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育90分钟。

3. 提前20分钟准备生物素化抗体工作液。

4. 洗板5次。

5. 空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液 (100 ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育60分钟。

6. 提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22~25℃)放置。

7. 洗板5次。

8. 空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100 ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵有30分钟。

9. 打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

10. 洗板5次。

11. 加入显色底物(TMB)100 ul/孔，37 ℃恒温箱，避光孵育15分钟。

12. 加入反应终止液100 ul/孔，混匀后即刻测量OD450(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。

结果判断:

1、每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。

2. 以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制并选取最佳拟合曲线，推荐使用二次多项式方程拟合。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后亚测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

2.10 统计分析

所有的数据均以三个独立试验的平均值±标准差。使用Student’s t检验和Graphpad Prism 8.0软件计算统计差异。P值<0.05表明有显著差异。显著差异为*P<0.05，**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001。